不同種質黃芩中黃酮類成分測定及分析△

高曉霞，徐榮，陳君，于晶，楊成民，劉賽，張永清，彭艷麗*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.中國醫學科學院 藥用植物研究所，北京 100193)

不同種質黃芩中黃酮類成分測定及分析△

高曉霞1，2，徐榮2，陳君2，于晶2，楊成民2，劉賽2，張永清1，彭艷麗1*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.中國醫學科學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：對不同種質黃芩中3種黃酮類成分和總黃酮進行測定和綜合評價，為遴選黃酮類成分含量高的黃芩種質提供依據。方法：采用改進的高效液相色譜法測定不同種質黃芩根中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量，采用UV-可見分光光度法測定總黃酮含量，應用主成分分析和灰色模式識別法驗證并綜合評價不同種質黃芩的化學質量。結果：黃芩苷、漢黃芩素及總黃酮含量在不同種質間差異顯著，其中13號黃芩種質黃芩苷和總黃酮含量最高，1號、7號黃芩種質黃芩苷、黃芩素與總黃酮含量均較高。主成分分析和灰色模式識別法分析結果驗證了本次試驗中1號、7號、13號為優良種質，可以作為黃芩新品種選育對象。結論：采用改進后的HPLC法可較好地測定黃芩3種黃酮類成分，不同種質黃芩中黃酮類成分含量均存在顯著差異；應用主成分分析和灰色模式識別法均遴選出了目標種質，該方法適用于不同種質藥材質量的綜合評價。

黃芩；黃酮類成分；主成分分析；灰色模式識別法

黃芩為唇形科多年生草本植物，以根入藥，為我國常用中藥，歷代本草均有收載，主產于華北、東北、西北等地區。現代藥理研究證明，黃芩中有效成分主要為黃酮類成分，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在抗氧化、抗炎、抗變態、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等方面具有顯著作用[1-2]。近年來以黃芩苷為主要原料的針劑、片劑、口服液等中成藥相繼投產，在國際、國內市場熱銷，隨著黃芩應用范圍的擴大，其需求量逐年增加，呈供不應求之勢，據全國中藥資源普查統計，山東每年提取廠用量為2.2萬t鮮藥材。

目前人工栽培的黃芩多來自野生種源，種質類型多樣，針對其需求選育不同目標的黃芩優良品種對穩定和保證藥材質量具有積極意義。研究證明，中藥發揮藥效作用是通過多成分作用多個靶點實現的，對中藥某一“有效指標成分”的定量分析并不能完全表現出藥材的內在品質。本文采用反高效液相色譜法同時測定了14份不同種質黃芩藥材的多個黃酮類成分[3]，并應用主成分分析和灰色模式識別法進行綜合評價，為黃芩藥材的質量評價及新品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

14份黃芩來自于早期課題組從山東、河北、寧夏、大連、北京等地收集的黃芩種質(表1)，經去雜純化、擴繁后開展種質評價和比較。本研究的14份黃芩樣品2013年6月扦插繁殖于藥用植物研究所栽培試驗地，每份種質分別移栽種植于3個小區，2014年11月3日黃芩枯葉后分別采挖其地下根部，每份種質取樣15株，3個重復。60 ℃烘干后粉碎，過40目篩，待測。

表1 不同種質黃芩收集信息

1.2 儀器與試劑

儀器：waters 2690高效液相色譜儀，Waters 996紫外檢測器，UV-2550型紫外-可見分光光度計，電子分析天平FA2004，精確到0.1 mg，DHG-9143BS-III型的電熱恒溫鼓風干燥箱，KQ-250DE型數控超聲機，HH-S8數顯恒溫水浴鍋，臺式高速離心機TG16MW。

試劑：乙醇為分析純，甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 采用PUROSPHER? RP-18 endcapped(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱，以甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%磷酸水(C)為流動相[4-8]，梯度洗脫程序為：0-10 min，A-B-C(38∶12∶50)；10～30 min，A-B-C(38∶12∶50→80∶10∶10)；30～35 min，A-B-C(80∶10∶10)；35～40 min，A-B-C(80∶10∶10-38∶12∶50)；每針進樣分析完畢后用初始流動相組成平衡5 min后再進行下一針分析。流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，紫外檢測波長為277 nm；進樣體積為10 μL，用waters2690工作站采集數據并分析。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品各4.68、2.98、3.09 mg先配制成一定濃度的對照品儲備液，再分別各自取適量到10 mL的容量瓶內配制成混合標準對照溶液。

1.3.3 供試品溶液的配制 稱取0.100 0～0.110 0 g黃芩干燥藥材(含水量均在4%左右)過40目篩的粉末，加50 mL 50%乙醇溶液，精密稱定，60 ℃、100 Hz超聲30 min，放至室溫，用50%乙醇補足差重，過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液[4，9-10]。

1.3.4 線性關系考察 精密吸取“1.3.2”項下的混合對照品溶液，以4、8、10、12、16、20 μL的體積按照“1.3.1”項下的色譜條件進樣測定，以峰面積A為縱坐標Y，以進樣量M(μg)為橫坐標X，繪制標準曲線，得到黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的回歸方程見表 2。

表2 黃芩藥材中3個化學成分的標準曲線方程、相關系數和線性范圍

1.3.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在2、4、6、10、12、14、18、20 h進樣10 μL，測得黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為3.3%、3.4%、3.3%。結果表明供試品溶液中上述3個成分在20h內穩定性良好。

1.3.6 精密度試驗 按照“1.3.3”項制備供試品溶液，以10 μL連續進樣6次。測得上述3個成分的峰面積RSD分別為1.4%、1.5%、1.4%，結果表明該儀器的精密度良好。

1.3.7 重復性試驗 取同一黃芩樣品5份，按照“1.3.3”項制備供試品溶液，以10 μL進樣測定。結果顯示上述3個成分的峰面積RSD分別為1.4%、4.3%、2.3%，符合規定。

1.3.8 回收率試驗 取已知含量(黃芩苷14.93%、黃芩素1.159%、漢黃芩素0.334 7%)的黃芩粉末樣品6份，按照“1.3.3”項制備供試品溶液，分別精密吸取樣品提取液1 mL、混標溶液1 mL于5 mL容量瓶中并定容[11-12]，以10 μL進樣測定，計算回收率，以上3個成分的平均回收率分別為98.2、%、102.3%、96.5%，RSD分別為1.65%、3.19%、3.41%。

1.3.9 總黃酮的測定 采用紫外—可見分光光度法測定[13-14]，取“1.3.3”項的供試品溶液適量，4800 r/s的轉速離心8分鐘，取100 μL上清液于10 mL的容量瓶(經濃度梯度考察樣品吸收度A值均在0.2～0.7范圍內)，用50%乙醇溶液定容后測定吸收度，全波長掃描結果顯示在280 nm處有最大吸收，故確定紫外吸收波長為280nm。

精密稱取黃芩苷對照品3.34 mg于10 mL容量瓶中用甲醇配制成標準對照品儲備液，分別吸取85、240、400、540、700、850 μL的對照品儲備液于25 mL的容量瓶中配制成不同濃度梯度的對照品溶液，經線性回歸分析得到吸收度Y(A)和濃度X(C，mg·mL-1)的回歸方程Y=71.568X-0.003，r=1.000，經方法學考察結果均符合規定，表明此方法準確可靠。

2 結果與分析

2.1 樣品含量的測定

按照上述高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法分別測定不同種質黃芩黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和總黃酮的含量，方差分析結果見表3、4。

表3 不同種質黃芩藥材黃酮類成分的含量比較(n=3)及評價

注：采用Duncan s multiple range test方法分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

表4 不同種質黃芩黃酮類成分方差分析及變異系數

注：表中*表示差異達顯著性(P<0.05)；**表示差異達極顯著性(P<0.01)。

從方差分析可知，黃芩苷、漢黃芩素、總黃酮在不同種質間差異顯著，在區組間差異不顯著，遺傳比較穩定，受環境影響??；其中13號的黃芩苷和總黃酮含量均為最高，1號、7號種質的黃芩苷、黃芩素及總黃酮含量均較高；黃芩素種間差異不顯著，但在區組間的差異達極顯著，表明黃芩素遺傳穩定性差，受環境因素影響較大，不適宜作為選種依據。

從變異系數[15-18]來看，黃芩苷和總黃酮在區組間的變異系數較小(分別為6.61%和5.08%)，進一步說明黃芩苷和總黃酮含量穩定，受環境因素影響小。而黃芩素和漢黃芩素在種源間和區組間變異系數均較大，說明二者種質間差異大，且遺傳穩定性較差。

2.2 主成分分析

試驗中不同種質黃芩的4個化學成分含量指標的主成分分析的特征值如表5所示。特征值≥1的主成分有2個，累積方差貢獻率達80.4%(一般大于70%為宜[19])。由于主成分是原始性狀的線性組合函數，根據計算樣本相關矩陣的特征向量(表5)可給出主成分的函數式為：

F1=0.57X1-0.12X2-0.55X3+0.60X4

F2=-0.23X1+0.97X2+0.03X3-0.01X4

由函數式看出，在第一主成分Z1中，總黃酮含量X4的系數最大，其次是黃芩苷X1的系數也較大，表明第一主成分主要是反映黃酮總含量的綜合指標，第二主成分Z2中，黃芩素含量X2的系數最大，表明第二主成分是反映黃芩素含量的綜合指標。

表5 黃芩主要化學成分含量主成分分析的特征值和特征向量

比較不同種質黃芩的各化學成分含量的主成分得分，見圖1可知，3號、6號、13號種質的Z1值較大，結合表3中的標準偏差可知，3號的總黃酮含量和6號的黃芩苷含量個體間取樣偏差較大，即最終判定13號的黃芩苷(或總黃酮)含量較高，適合作為黃芩提取物原料來源的黃芩種質；11號的Z2值較大，但表3中其黃芩素的標準偏差較大；位于第一象限對角線左右的1號、7號種質的Z1和Z2均為正值，且Z2/Z1值較接近于1，表明黃芩素與黃芩苷(或總黃酮)不僅含量高，且貢獻比例相當，這與臨床用藥安全規范中黃芩素與黃芩苷含量比值規定有一定的聯系，故推測這2份黃芩種質適合用于臨床中藥飲片或中成藥原料；位于第一象限的8號種質Z2得分稍較高，屬于黃芩素含量高的種質類型，但Z1得分較低，即藥典規定質量指標黃芩苷含量不高；其余種黃芩源主成分得分值特征性不強。

2.4 灰色模式識別法驗證——綜合評價黃芩藥材質量

2.4.1 選擇參考序列 上述一共有14份樣品，每份樣品有4項評價指標，則組成的評價單元序列為{Xij}(i=1，2…14；j=1，2，3，4)。其中最佳參考序列{Xsj}為14份樣品對應指標的最大值，最差參考序列{Xtj}為14份樣品對應指標的最小值[20]。

2.4.3 計算關聯系數 相對于最優參考序列關聯系數如下：

其中，Δmin=min|Yij-Ysj|，Δmax=max|Yij-Ysj|，ρ為分辨系數，取值為0.5[21]。

相對于最差參考序列關聯系數如下：

其中，Δ′min=min|Yij-Ytj|，Δ′max=max|Yij-Ytj|，ρ為分辨系數，取值為0.5。

2.4.4 計算關聯度

圖1 不同種質黃芩化學成分主成分分析的得分值坐標分布圖

相對于最優參考序列關聯度：

相對于最差參考序列關聯度：

2.4.5 計算相對關聯度Ri(s)越大，表明評價單元序列相對于最優參考序列的關聯度越大，評價單元越佳；反之，Ri(t)越小，評價單元越好。故定義評價單元序列{Xij}同時相對于最優參考序列{Xis}和最差參考序列{Xit}的相對關聯度為

對于不同種質黃芩各黃酮類成分含量數據進行關聯度分析，結果見表3中Ri值，以Ri值進行種質優良排序可知，7號、1號、5號、13號和8號依次排在前五位，若選擇Ri值在0.535以上為優良種質[20]，則從化學質量角度認為1號、5號、7號和13號為化學質量優良的黃芩種質。此結果與上述主成分分析結果高度一致，驗證了分析結果的準確性。此外，5號種質化學質量綜合評價排名靠前，但其總黃酮含量個體間偏差較高(見表3)，前期性狀調查結果也表明其外觀形態性狀層次不齊、產量性狀一般，所以即使化學質量稍好，也不具備優良種質的條件。因此1號、7號、13號種質在化學質量綜合評價之后結合前期性狀調查結果，可作為黃芩新品種選育對象。

3 結論與討論

本試驗在已報道方法的基礎上略加改進的色譜條件能使所需測定的化學成分很好地分離。通過種質間和區組間方差分析及變異系數比較，發現不同種質黃芩藥材中黃芩苷、漢黃芩素及總黃酮含量差異顯著；而黃芩素在區組間差異達極顯著性，表明其受環境因素影響較大；黃芩苷和總黃酮在區組間和種源間的變異系數均小于黃芩素和漢黃芩素，表明黃芩苷與總黃酮的遺傳穩定性較好，提示在黃芩品種選育時，可以獨立選擇遺傳穩定性好的黃芩苷(《中華人民共和國藥典》規定黃芩苷為限定指標)或總黃酮作為化學質量評價指標。

化學成分灰色模式識別法不宜獨立評價中藥材質量好壞，只能在標準統計分析之后對分析結果進行驗證。以品質為主要目標的育種工作中，既要考察有效化學成分的含量，也要把握種質的性狀特征。本研究通過測定黃芩中黃酮類成分的含量，綜合評價了不同黃芩種質的藥材質量，對指導黃芩優良品種選育具有借鑒和參考作用。

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DeterminationandAnalysisofFlavonoidsIngredientsofDifferentScutellariaeRadixGermplasms

GAO Xiaoxia1，2，XURong2，CHENJun2，YUJing2，YANGChengmin2，LIUSai2ZHANGYongqin1，PENGYanli1*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.InstituteofMedicinalPlants，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective：To provide a basis for selecting high content of flavonoids ingredients of Scutellariae Radix germplasms by determination and analysis on three flavonoids ingredients and the total flavonoids of different Scutellariae Radix germplasms.Methods：The content of baicalin，baicalein and wogonin were determined by HPLC.And the total content of flavonoids of different ScutellariaeRadixgermplasm was determined byultraviolet-visible spectrophotometry.Principal component analysis and grey pattern recognition method was applied to comprehensive evaluation of different Scutellariae Radix germplasms quality.Results：Variance analysis results showed that the content of baicalin，wogonin and the total flavonoids were extremely significantly different among different germplasms.The baicalin and total flavonoids in germplasm 13 was higher than other germplasms.Germplasm 1 and 7，of which baicalin，baicalein and total flavonoids were all high.The analysis results of grey pattern recognition method verified that the Scutellariae Radix of germplasm 1，7 and 13 are optimal germplasms，which can be as selection objects ofScutellariabaicalensisnew varieties.Conclusion：The improved HPLC method is fit for determination for flavonoids ingredients of scutellariae Radix.There are significant difference between different Scutellariae Radix germplasms.Principal component analysis and the grey pattern recognition method is suitable for quality evaluation of different Scutellariae Radix germplasms.

Scutellariae Radix；flavonoids ingredients；principal component analysis；grey pattern recognition method

2015-12-17)

中醫藥行業科研專項(201107011)；工信部中藥材扶持資金(2011-340)

*

彭艷麗，教授，研究方向：生藥及中藥的質量控制與品質評價；E-mail：pyl567@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.020