基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析石吊蘭全草化學(xué)成分△

胡峻，齊夢蝶 ，張權(quán)，秦振嫻，康利平，南鐵貴，楊健，袁媛，詹志來*，劉勇*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析石吊蘭全草化學(xué)成分△

胡峻1，齊夢蝶1，張權(quán)1，秦振嫻1，康利平2，南鐵貴2，楊健2，袁媛2，詹志來2*，劉勇1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102；
2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700)

目的：建立石吊蘭全草化學(xué)成分的一種超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析方法。方法：80%甲醇-水溶液超聲提取石吊蘭，經(jīng)Waters ACQUITY UPLC-BEH-C18S色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以0.1%甲酸水-乙腈為流動相梯度洗脫，檢測波長為210～400 nm，ESI負(fù)離子模式檢測，根據(jù)精確分子量及碎片信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配進行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果：從石吊蘭全草中共鑒定出48個成分，其中42個苯乙醇苷類化合物、3個黃酮類化合物、3個其他類型化合物，有14個化合物為苦苣苔科中首次發(fā)現(xiàn)。結(jié)論：本研究首次對石吊蘭化學(xué)成分進行整體研究，為該植物的深入研究奠定基礎(chǔ)。

液質(zhì)聯(lián)用；石吊蘭；化學(xué)成分

石吊蘭LysinotuspauciflorusMaxim.為苦苣苔科吊石苣苔屬石吊蘭的全草，別名黑烏骨、石豇豆、石澤蘭等，產(chǎn)于四川西部，生于山谷林中石上，海拔700～1 400 m，全株有祛風(fēng)止咳、消食健脾等功效[1]。石吊蘭民間多常用，主要用來治療風(fēng)濕骨痛、咳喘痰多及跌打損傷等癥。石吊蘭主要成分為黃酮和苯乙醇苷類成分[2-3]。目前對于石吊蘭的化學(xué)成分研究較少，尤其是整體的化學(xué)成分研究還未見報道。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)具有分離速度快、靈敏度高、可提供精確相對分子量等優(yōu)點，可以在缺乏對照品的情況下對化學(xué)成分進行解析。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)對石吊蘭中的化學(xué)成分進行鑒別分析，為該植物的進一步研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITYI-Class 超高效液相色譜儀-Waters Xevo-G2-S Q-TOF MS 質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Waters公司)、Waters ACQUITY UPLC-BEH-C18S色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)、BSA224S型萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)、Centrifuge 5415D型離心機(德國Eppendorf公司)、SB-800-DTD型超聲清洗機，超聲功率500 W(寧波新芝生物科技股份有限公司)、Pacific T-Ⅱ型超純水儀(美國Thermo公司)。水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純(美國Fishier Scientific公司)，其余試劑均為分析純，0.22 μm疏水PTFE微孔濾頭(Millipor公司，美國)。

1.2 材料

對照品有Acteoside、Calceolarioside B、Forsythoside B、Plantamajoside(成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98%)。

石吊蘭采集于湖南安化，經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所李振宇研究員鑒定為吊石苣苔屬石吊蘭LysionotuspauciflorusMaxim.，樣品存放于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。

2 方法

2.1 供試品和對照品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備 取石吊蘭藥材，粉碎，過40目篩，精密稱取藥材粉末2.0 g置具塞三角瓶中，加入80%甲醇水溶液15 mL，超聲(功率500 W)提取1 h，放至室溫，補重。樣品用12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，供分析用。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取各種對照品適量，置10 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲使其溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm疏水PTFE微孔濾頭過濾，備用。

2.2 液相和質(zhì)譜條件

2.2.1 液相色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC-BEH-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～10%B；5.5～15 min，40%～65%B；18～23 min，70%～100%B；23～26 min，100%B；26～26.1 min，100%～5%B；26.1～28.5 min，5%B)；流速為0.5 mL·min-1；柱溫為0 ℃；進樣量為1 μL。檢測波長為190～400 nm。

2.2.2 質(zhì)譜條件 Waters Xevo-G2-S Q-TOF MS 質(zhì)譜系統(tǒng)，采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式掃描，毛細(xì)管電壓為2000 V，錐孔電壓為 40 V，除溶劑氣體為氮氣，900 L·h-1，除溶劑溫度為450 ℃，離子源溫度為 100 ℃，掃描范圍為m/z50～1500 Da，掃描時間為0.2 s，碰撞氣體為氬氣。低能量掃描時碰撞能量為6 eV，高能量掃描時碰撞能量為25～45 eV。準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)用leucine enkephalin作校正液。MassLynx 4.1液質(zhì)系統(tǒng)控制軟件(Waters公司)。

3 結(jié)果與分析

3.1 UPLC-Q-TOF-MS全掃描的基峰離子流色譜結(jié)果

為了更全面地檢測石吊蘭藥材中所含的化合物信息，對提取溶劑、色譜條件、質(zhì)譜條件等進行了優(yōu)化，選擇最優(yōu)的條件對石吊蘭及對照品進行LC-MS分析。其中負(fù)離子模式下顯示出更為豐富的信息，總離子流圖見圖1。

3.2 石吊蘭UPLC-Q-TOF-MS分析及鑒定

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Masslynx 4.1軟件中，根據(jù)負(fù)離子模式一級質(zhì)譜的分子離子峰得到化合物的相對分子質(zhì)量，計算元素組成；再根據(jù)二級質(zhì)譜信息，結(jié)合對照品的色譜保留時間、軟件自帶的數(shù)據(jù)庫以及Chemspider(http：//www.chemspider.com/)及Scifinder(https：//scifinder.cas.org/)得到候選化合物。結(jié)合DAD特征光譜及文獻[4-35]，從石吊蘭總離子流圖中選擇相應(yīng)較明顯的峰進行鑒定，共鑒定了48個化合物，其中有42個為苯乙醇苷類化合物、3個為黃酮類化合物、3個為其他類型化合物，有14個化合物為苦苣苔科中首次發(fā)現(xiàn)，見表1。

注：A.全部總離子流；B.9～14 min總離子流。圖1 負(fù)離子模式下UPLC-Q-TOF-MS分析石吊蘭總離子流圖

表1 UPLC-Q-TOF-MS鑒定分析石吊蘭全草中化學(xué)成分(負(fù)離子模式)

表1(續(xù))

表1(續(xù))

注：*為經(jīng)對照品對照確定的成分，#為首次在苦苣苔科中發(fā)現(xiàn)的成分。

從表1的結(jié)果可以觀察到，石吊蘭中含有較多的同分異構(gòu)體。本文采用化合物的ClogP參數(shù)對其同分異構(gòu)體進行區(qū)分，舉例如下。

化合物11、12和16：準(zhǔn)分子離子峰均為m/z771.23[M-H]-，推測三者為同分異構(gòu)體，二級質(zhì)譜為m/z609.18[M-H-C6H10O5]-，447.15[M-H-C6H10O5-C9H8O3]-，315.11[M-H-C6H10O5-C9H8O3-C5H8O4]-，m/z179.03、161.02為咖啡酰基的碎片離子。根據(jù)文獻[7-9]推測三者為2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-6-O-(2，3，4，5-tetrahydroxycyclopentyl)-4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate]-β-D-glucopyranoside、rashomoside A或2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-O-D-apio-β-D-furanosyl-(1→3)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propen-oate]-β-D-glucopyranoside，計算3個化合物Clogp分別為-3.4、-3.1，-1.8，結(jié)合出峰順序推測化合物11為2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-6-O-(2，3，4，5-tetrahydroxycyclopen-tyl)-4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propeno-ate]-β-D-glucopyranoside，12為rashomoside A，16為2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-O-D-apio-β-D-furanosyl-(1→3)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-prope-noate]-β-D-glucopyranoside。

化合物17、19和22：準(zhǔn)分子離子峰均為m/z609.18[M-H]-，推測三者都為同分異構(gòu)體，二級質(zhì)譜m/z447.15[M-H-C9H8O3]-，315.11[M-H-C9H8O3-C5H8O4]-，m/z179.03、161.02為咖啡酰基的碎片離子。根據(jù)文獻[13-15]推測化合物三者為2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-2-O-D-apio-β-D-furan-osyl-4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propeno-ate]-β-D-glucopyranoside、calceolarioside C或calceo-ralarioside E，計算3個化合物Clogp分別為-2.0、-1.5、-0.2，結(jié)合出峰順序推測化合物17為2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-2-O-D-apio-β-D-furanosyl-4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate]-β-D-glucopyranoside，19為calceolario-side C，22為calceoralarioside E。

化合物20：準(zhǔn)分子離子峰為m/z639.19[M-H]-，二級質(zhì)譜m/z477.16[M-H-C9H8O3]-，315.11[M-H-C9H8O3-C6H10O5]-，m/z179.03、161.02為咖啡酰基的碎片離子，根據(jù)對照品比對，化合物20為plantamajoside，其可能的裂解規(guī)律見圖2。

圖2 Plantamajoside可能的裂解途徑(負(fù)離子模式)

4 討論

本研究首次運用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對石吊蘭中化學(xué)成分進行分析，根據(jù)質(zhì)譜及精確分子量，參考石吊蘭化學(xué)成分的研究及天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫搜索等方法，共鑒定了48個成分。石吊蘭中含有較多同分異構(gòu)體，本文采用化合物的Clogp參數(shù)對其同分異構(gòu)體進行了有效的區(qū)分。

本研究表明石吊蘭中含有豐富的苯乙醇苷類成分，而苯乙醇苷類成分是一類具有良好醫(yī)療價值的化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[36-38]，尤其以抗氧化活性最為顯著。對石吊蘭化學(xué)成分的研究及藥理和構(gòu)效關(guān)系研究將對石吊蘭植物資源開發(fā)利用具有實際意義。

[1] 中國藥材公司.中國中藥資源志要[M].北京：科學(xué)出版社，1994：1177.

[2] LIU Y，WAGNER H，BAUER R.Nevadensinglycosidesfrom Lysionotus pauciflorus[J].Phytochemistry，1996，42(4)：1203-1205.

[3] Liu Y，Wagner H，Bauer R.Phenylpropanoids and flavonoid glycosides fromLysionotuspauciflorus[J].Phytochemistry，1998，48(2)：339.

[4] Liu P，Deng R X，Duan H Q，et al.Phenylethanoid glycosides from the roots ofPhlomisumbrosa[J].J Asian Nat Prod Res，2009，11(1)：69-74.

[5] Juliao，Lisieux de S，Piccinelli，et al.Phenylethanoid glycosides fromLantanafucatawith in vitro anti-inflammatory activity[J].J of Nat Prod，2009，72(8)：1424-1428.

[6] Liu Y，Seligmann O，Wagner H，et al.Paucifloside，a new phenylpropanoid glycoside fromLysionotuspauciflorus[J].Nat Prod Lett，1995，7(1)：23-28.

[7] Zubair，Muhammad，Nybom H，et al.Detection of genetic and phytochemical differences between and within populations ofPlantagomajorL.(plantain)[J].Scientia Horticulturae(Amsterdam，Netherlands)，2012，136：9-16.

[8] Zhou Z L，Zhang H L.Phenolic and iridoid glycosides from the rhizomes ofCyperusrotundusL.[J].Med Chem Res，2013，22(10)：4830-4835.

[9] Li C T，Liu Y Q，Abdulla，et al.Determination of phenylethanoid glycosides inLagotisbrevitubaMaxim.by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Anal Lett，2014，47(11)：1862-1873.

[10] Kiem P V，Quang T H，Huong T T，et al.Chemical constituents ofAcanthusilicifoliusL.and effect on osteoblastic MC3T3E1 cells[J].Arch Pharm Res，2008，31(7)：823-829.

[11] Yang J H，Kondratyuk T P，Jermihov K C，et al.Bioactive compounds from the fernLepisoruscontortus[J].J Nat Prod，2011，74(2)：129-136.

[12] Mathuram V，Patra A，Kundu A B.A phenyl propanoid glycoside fromNyctanthesarbortristis[J].J Ind Chem Soci，1997，74(8)：653-655.

[13] Lin S，Wang S J，Liu M T，et al.Glycosides from the stem bark ofFraxinussieboldiana[J].J Nat Prod，2007，70(5)：817-823.

[14] Stanoeva J P，Stefova M，Stefkov G K，et al.Chemotaxonomic contribution to theSideritisspecies dilemma on the Balkans[J].Biochem Syst Ecol，2015，61：477-487.

[15] Nazemiyeh，H，Shoeb M，Movahhedin N，et al.Phenolic compounds and their glycosides fromStachysschtschegleevii(Lamiaceae)[J].Biochem Syst Ecol，2006，34(9)：721-723.

[16] Miyase T，Mimatsu A.Acylated iridoid and phenylethanoid glycosides from the aerial parts ofScrophularianodosa[J].J Nat Prod，1999，62(8)：1079-1084.

[17] Taskova R M，Kokubun T，Ryan K G，et al.Phenylethanoid and iridoid glycosides in the New Zealand snow hebes(Veronica，Plantaginaceae)[J].Chem Pharm Bull，2010，58(5)：703-711.

[18] Suo M R，Ohta T，Takano F，et al.Bioactive phenylpropanoid glycosides fromTabebuiaavellanedae[J].Molecules，2013，18：7336-7345.

[19] 郗峰，鄧君，王彥涵.藏藥短管兔耳草中1個新苯乙醇苷類化合物[J].中國中藥雜志，2009，34(16)：2054-2056.

[19] Wang Li N，Guo D X，Wang，S Q，et al.Phenolic glycosides from the Chinese Liverwort Reboulia hemisphaerica[J].Hel Chim Acta，2011，94(6)：1146-1152.

[21] Morikawa T，Pan Y，Ninomiya K，et al.Acylated phenylethanoid oligoglycosides with hepatoprotective activity from the desert plantCistanchetubulosa[J].Bioor Med Chem，2010，18(5)：1882-1890.

[22] Zhou F Y，She J，Wang Y G.Synthesis of a benzyl-protected analog of arenarioside，a trisaccharide phenylpropanoid glycoside[J].Carbohydr Res，2006，341(15)：2469-2477.

[23] Lei L，Jiang Y，Liu X M，et al.New glycosides fromCistanchesalsa[J].Helv Chim Acta，2007，90(1)：79-85.

[24] Kernan M R，Amarquaye A，Chen J L，et al.Antiviral phenylpropanoid glycosides from the medicinal plantMarkhamialutea[J].J Nat Prod，1998，61(5)：564-570.

[25] Yadava R N，Satnami D K.Chemical constituents fromCassiaoccidentalisLinn[J].Indian J Chem(Sec.B)：Org Chem Including Med Chem，2011，50B(8)：1112-1118.

[26] Bagrii A K，Kurmaz B V，Litvinenko V I.New bioside of quercetin[J].Khim Prir Soedin，1966，2(2)：85-90.

[27] 張忠立 左月明 徐璐，等.三白草黃酮類化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2011，42(8)：1490-1493.

[28] Porter E A，Kite G C，Veitch N C，et al.Phenylethanoid glycosides in tepals of Magnolia salicifolia and their occurrence in flowers of Magnoliaceae[J].Phytochemistry，2015，117：185-193.

[29] Liu M M，Zhou L，He P L，et al.Discovery of flavonoid derivatives as anti-HCV agents via pharmacophore search combining molecular docking strategy[J].Euro J Med Chem，2012，52：33-43.

[30] Adhikari B，Devkota H P，Joshi K R，et al.Two new diacetylene glycosides：bhutkesoside A and B from the roots ofLigusticopsiswallichiana[J].Nat Prod Res，2015.DOI:10.1080/14786419.2015.1118635.

[31] Tanikawa T，F(xiàn)ridman M，Zhu W J，et al.Using Biological Performance Similarity To Inform Disaccharide Library Design[J].J Am Chem Soc，2009，131(14)：5075-5083.

[32] Jin Q L，Jin H G，Shin J E，et al.Phenylethanoid glycosides fromDigitalispurpureaL.[J].Bull Kore Chem Soc，2011，32(5)：1721-1724.

[33] Jiang T Fu，Ou Q Y，Shi Y.Separation and determination of phenylpropanoid glycosides fromPedicularisspecies by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr A，2003，986(1)：163-167.

[34] Fan L，Liao C H，Li S G，et al.Phenylethanoid and secoiridoid glycosides from the leaves ofLigustrumpurpurascens[J].Phytochem Lett，2015，13：177-181.

[35] Yuan J Q，Qiu L，Zou L H，et al.Two new phenylethanoid glycosides fromCallicarpalongissima[J].Helv Chim Acta，2015，98(4)：482-489.

[36] Hu X P，Shao M M，Song X，et al.Anti-influenza virus effects of crude phenylethanoid glycosides isolated fromligustrumpurpuras.censvia inducing endogenous interferon-γ[J].J Ethnopharmacol，2015，179：128-136.

[37] Wang Y J，Zhou S M，Xu G，et al.Interference of phenylethanoid glycosides fromCistanchetubulosawith the MTT assay[J].Molecules，2015，20(5)：8060-8071.

[38] Encalada M A，Rehecho S，Ansorena，Di，et al.Antiproliferative effect of phenylethanoid glycosides from Verbena officinalis L.on colon cancer cell lines[J].LWT-Food Sci Technol，2015，63(2)：1016-1022.

StudyonChemicalConstituentsinWholeHerbofLysinotuspauciflorusbyUPLC-Q-TOF-MS

HU Jun1,QIMengdie1,ZHANGQuan1,QINZhenxian1,KANGLiping2,NANTiegui2,YANGJian2,YUANYuan2,ZHANZhilai2*,LIUYong1*

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China；2.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,StateKeyLaboratoryBreedingBaseofDao-diHerbs,Beijing, 100700,China)

Objective:To analyze the chemical components in the whole herb ofLysinotus.pauciflorusMaxim by Ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS).Methods:Crude drug were extracted with 80% methanol in water. A Waters ACQUITY UPLC-BEH-C18S column (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) was used with a gradient elution of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid. The mass spectrometry equipped with ionization source was used and the data was collected under negative ion mode. And the components identification was applied by the precise molecular weight and fragmentation information, combined with a database match.Results:Forty-eight compounds were identified with 42 phenylethanoid glycosides, 3 flavonoids and 3 other compounds, among them, 14 compounds were firstly identified in Gensneriaceae plant.Conclusion:We have quite completely identified the components in the whole herb ofL.pauciflorusfor the first time, which lay the foundation for the further study and utilization of the medicinal resources.

UPLC-Q-TOF-MS；LysinotuspauciflorusMaxim.；chemical constituents

2016-03-17)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407003)

*

劉勇，教授，研究方向：藥用植物親緣學(xué)、中藥質(zhì)量與開發(fā)，Tel：(010) 84738656，E-mail：yliu0126@aliyun.com；詹志來，助理研究員，研究方向：中藥資源鑒定與評價，Tel：(010)64014411-2847，E-mail：zzlzhongyi@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.002