白術利尿作用研究△

陳靜，孫云超，冉小庫，袁穎，竇德強

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

白術利尿作用研究△

陳靜，孫云超，冉小庫，袁穎，竇德強*

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

目的：研究白術及其拆分組分對大鼠的利尿作用。方法：采用多模式聯用的方法對白術化學組分進行拆分；通過預先胃水負荷模型，以6 h尿量為指標考察白術及其拆分組分對水負荷大鼠利尿作用；進一步測定紅細胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力、血尿素氮濃度、腎髓中碳酸酐酶水平和Na+、K+、Cl-排出量，研究其相關機理。結果：高劑量白術水煎液和白術揮發油組分對大鼠有一定的抗利尿作用；與空白組相比，白術水煎液及其拆分組分組紅細胞中Na+-K+-ATP酶活力、腎髓中Na+-K+-ATP酶和碳酸酐酶水平無顯著變化。結論：白術對正常動物無利尿作用，相反表現出一定的抗利尿作用，且首次研究發現白術揮發油有一定的抗利尿作用。

白術；拆分組分；利尿作用

白術為菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，性溫，味甘、苦，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功能，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安[1]。近年來關于白術藥理作用有較多報道，如補脾作用[2]、抑制胃腸功能作用[3]、抗炎作用[4]等。然而文獻報道中關于白術利尿作用有一定差異，有文獻報道白術具有利尿作用[5]；也有文獻報道白術無利尿作用，而在高劑量呈現一定的抗利尿作用[6]。目前關于白術拆分組分利尿作用無相關報道。前期我們對白術的化學組分進行拆分，并對拆分組分間的差異度及化學成分進行表征[7-8]。本實驗以消化道水負荷模型大鼠為對象，觀察大鼠6 h內排尿量，并測定部分生化指標，研究白術及其拆分組分的利尿作用及相關機理，為白術藥理作用研究及臨床用藥提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

雄性SD大鼠，體重200～220 g(遼寧長生生物技術有限公司)，合格證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.2 藥物與試劑

白術于2012年11月采自浙江于潛，由遼寧中醫藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的根莖(批號：20121101)。稱取白術藥材400 g，冷水充分浸泡，煎煮2次后，合并藥液過濾，濃縮為0.72 g·mL-1的白術水煎液，4 ℃保存備用。白術的給藥劑量按照《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)中規定的飲片成人服用量折算大鼠的給藥劑量作為1倍量，同時大鼠每天按1 mL·(100g)-1灌胃給藥，折算白術1倍給藥濃度為0.12 g·mL-1。

氫氯噻嗪(山西云鵬制藥有限公司，批號：A130702)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津市大茂化學試劑廠)；0.9%氯化鈉溶液(黑龍江科倫制藥有限公司，批號：12060201-2)；血紅蛋白測定試劑盒(長春匯力生物技術有限公司，批號：2014013)；超微量ATP酶(Na+/K+)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140627)；ATP酶不高速測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140627)；考馬斯亮藍測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140619)；大鼠碳酸酐酶(CA)Elisa測試盒(R&D，批號：201406)；尿素氮(BUN)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140629)。

1.3 儀器

代謝籠；UV-2100紫外分光光度計(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；SUNRISE型酶標儀(瑞士TECAN公司)；7600-020全自動生化分析儀，Na+、K+、Cl-電極配套標準液、稀釋液和比較電極液(日本株式會社日立高新技術有限公司)。

2 方法

采用Aston方法[9-11]對大鼠進行篩選，將大鼠置于代謝籠中適應3 d，禁食不禁水18 h后，按2.5 mL·(100 g)-1劑量灌胃去離子水，收集2 h尿液，排尿質量大于灌胃離子水質量40%的大鼠，即為合格。

2.1 不同劑量白術水煎液對大鼠利尿作用研究

選取合格大鼠50只，分為空白對照組、陽性對照組(氫氯噻嗪)、白術1倍劑量組、白術3倍劑量組和白術6倍劑量組，每組10只。

采用代謝籠法[9-11]，各組按規定劑量灌胃給藥，連續給藥9 d。末次給藥前禁食不禁水24 h，各組按5 mL·(100g)-1劑量灌胃0.9%氯化鈉溶液，可使動物細胞外液增加，模擬水鈉潴留狀態。20 min后，按1 mL·(100g)-1劑量灌胃給藥，空白組給予同體積的水。給藥后，輕壓大鼠的下腹部使膀胱中尿液排盡，然后置于代謝籠內，每隔3 h收集尿液1次，共收集2次，最后一次收集前輕壓大鼠的下腹部使膀胱中尿液排盡，記錄給藥后各組大鼠6 h內的尿量。室溫控制在(20±1)℃為宜。

2.2 白術拆分組分利尿作用研究

鑒于2.1項下的結果可知，白術6倍劑量水煎液有較弱的抗利尿作用，因此對白術6倍拆分組分進行利尿實驗研究。選出合格大鼠80只，隨機分為空白組(NO)、陽性組(PO)、白術6倍量組(WD)、白術6倍揮發油組(VOF)、白術6倍石油醚組(PEF)、白術6倍樹脂醇洗組(AEF)、白術6倍樹脂水洗組(WEF)和白術6倍粗多糖組(CPF)，每組10只。

2.2.1 白術化學組分拆分 參照文獻[7-8]，通過多模式(溶劑分配、大孔樹脂)聯用的化學成分拆分方法，對白術中化學拆分組分進行穩定、有效制備，得到揮發油組分、石油醚組分、樹脂醇洗組分、樹脂水洗組分和粗糖組分。并通過HPLC等法對各組分代表性成分進行分析，結果表明揮發油組分主要為蒼術酮、萜及倍半萜類成分；石油醚組分主要為白術內酯類成分；樹脂醇洗組分主要為一些聚炔類化合物；樹脂水洗組分含有5-羥甲基糠醛和小分子糖等化合物；粗糖組分主要成分為低聚果糖。

2.2.2 白術拆分組分對大鼠利尿作用研究 按其文獻中白術各拆分收率，用0.5%的CMC-Na混懸液將白術各拆分組分混懸至相應濃度即可[7]。各組按規定劑量灌胃給藥，連續給藥9 d。第9天給藥前禁食不禁水24 h，按照2.1項下進行實驗。

2.2.3 紅細胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力測定 末次給藥后，取血，3000 r·min-1離心15 min，取下層紅細胞200 μL，0.9%氯化鈉溶液吹洗3次，加入800 μL雙蒸水，37 ℃水浴 1 h，制備溶血液，備用。紅細胞Na+-K+-ATP酶活性的測定根據血紅蛋白測定試劑盒(疊氮高鐵法)和超微量ATP酶(Na+-K+)測試盒使用說明，分別測定血紅蛋白含量和Na+-K+-ATP酶活性。

將大鼠處死后，解剖，取整個右腎內髓部分，用0.9%氯化鈉溶液勻漿處理得2%腎髓組織液，3000 r·min-1離心10 min，吸取上清液。根據考馬斯亮藍測定試劑盒和不高速ATP酶測試盒使用說明，分別測定2%組織液總蛋白含量和Na+-K+-ATP酶活性。

2.2.4 尿液中Na+、K+、Cl-排出量測定 采集6 h內尿液，離心，得上清液，待測。采用日立7600全自動生化儀的電解質分析模塊，用所配標準液定標，測定各配質控品，結果處于質控數值范圍內。通過離子選擇電極法(ISE)測定Na+、K+、Cl-濃度，再通過換算得到各組大鼠的Na+、K+、Cl-排出量。

2.2.5 血尿素氮含量測定 末次給藥后，取血，室溫靜置30 min，3000 r·min-1離心15 min，制備血清，按照尿素氮試劑盒說明書操作步驟測定尿素氮。

2.2.6 碳酸酐酶的測定 將大鼠處死后，解剖，取左腎的髓部，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，吸干水分稱重，按照1∶9加入0.9%氯化鈉溶液，于組織勻漿機制作勻漿，3000 r·min-1離心20 min，吸取上清液，-20℃保存，待測CA。按照CA Elisa試劑盒說明書操作步驟進行測定。

2.3 統計方法

3 結果

3.1 不同劑量白術水煎液對大鼠利尿作用結果

由表1知，與空白對照組相比，白術1、3倍劑量組無統計學差異(P>0.05)，而白術6倍劑量組在0～3 h內尿量顯著性降低(P<0.05)，該結果提示白術6倍水煎液有一定的抗利尿作用。

3.2 白術拆分組分對大鼠利尿作用結果

由表2可知，與空白對照組相比，白術6倍揮發油組在0～3h及6 h內總尿量均顯著降低(P<0.01)；該結果提示白術6倍揮發油組分對大鼠有一定抗利尿作用；其余各白術6倍拆分組分組在0～3、3～6 h及總尿量均無統計學差異(P>0.05)。

表1 不同劑量白術水煎液對大鼠利尿作用結果 /mL

注：與空白對照相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表2 白術拆分組分對大鼠利尿作用結果 /mL

3.3 白術拆分組分對紅細胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力的影響

由圖1知，與空白對照相組比，白術及其各拆分組中大鼠的紅細胞和腎髓中Na+-K+-ATP酶活力無統計學差異(P>0.05)。

圖1 白術拆分組分對紅細胞和腎髓Na+-K+-ATP酶活力的影響

3.4 白術拆分組分對大鼠尿液6 h內Na+、K+、Cl-排出量的影響

由圖2知，與空白對照組相比，在K+排量上，白術6倍粗多糖組顯著增加(P<0.05)，白術6倍劑量組顯著增加(P<0.01)；在Na+排量上，白術6倍揮發油組顯著增加(P<0.05)，白術6倍劑量組、白術6倍樹脂水洗組和白術6倍粗多糖組顯著增加(P<0.01)；在Cl-排量上，白術石油醚組、白術6倍樹脂水洗組和白術6倍粗多糖組顯著增加(P<0.05)，白術6倍劑量組顯著增加(P<0.01)；在Na+/K+上，白術6倍揮發油組顯著增加(P<0.05)。

圖2 白術拆分組分對大鼠尿液6 h內Na+、K+、Cl-排出量的影響

3.5 白術拆分組分對血清中尿素氮的影響

由圖3知，與空白對照組相比，白術及其各拆分組對大鼠血液中尿素氮含量無統計學差異(P>0.05)，該結果提示白術及其拆分組分對大鼠腎小球濾過功能無明顯影響。

3.6 白術拆分組分對腎髓中CA水平的影響

由圖4知，與空白對照相組比，白術及各拆分組分組中大鼠腎髓中碳酸酐酶濃度無統計學差異(P>0.05)。

圖3 白術及其拆分組分對血清中尿素氮的影響

圖4 白術拆分組分對大鼠CA水平的影響

4 討論

白術為常用中藥，素有“十方九用”、“南術北參”之稱。作者以大鼠為實驗對象，研究表明連續灌胃給藥時，相當于生藥1.2 g·kg-1(相當于臨床成人用藥1倍量)和3.6 g·kg-1白術水煎液組中大鼠排尿量無顯著變化，而相當于生藥7.2 g·kg-1白術水煎液組中大鼠尿量顯著降低。該結果提示高劑量白術(7.2 g·kg-1)對正常大鼠有一定的抗利尿作用。該結果進一步證實了施文榮等[6]報道的白術低、高劑量水煎液連續給藥時對小鼠有一定的抗利尿作用。我們進一步研究了白術高劑量(7.2 g·kg-1)下各拆分組分的利尿作用，以探究白術利尿作用的有效物質。結果尚未證實如陳敏珠等[5]報道的白術利尿作用的有效成分可能為兩部分，一部分為脂溶性的揮發油，一部分為水溶性的有機物，相反作者發現白術揮發油對正常大鼠有一定的抗利尿作用。

Na+-K+-ATP酶是對細胞內外鈉和鉀離子進行交換的酶，對維持細胞內Na+、K+濃度的相對恒定、保持細胞內外環境適當的滲透壓平衡等具有重要意義。紅細胞Na+-K+-ATP酶活力和腎髓Na+-K+-ATP酶活力測定結果研究表明白術及其拆分組分對Na+-K+-ATP酶活力沒有顯著影響，提示白術并非通過抑制Na+與K+交換從而影響細胞內外滲透壓產生抗利尿作用。尿液的形成包括腎小球濾過、腎小管和集合管的重吸收及分泌。筆者對血中尿素氮濃度測定結果表明白術及其拆分組分對腎小球的濾過率無顯著影響。碳酸酐酶主要作用為H+-Na+交換，碳酸酐酶抑制時H+排出量減少，Na+量排出量增多而產生利尿作用。腎髓碳酸酐酶濃度檢測結果表明白術及其拆分組分對碳酸酐酶濃度無顯著影響。同時我們對各組大鼠6 h內Na+、K+、Cl-排出量進行了檢測，鑒于白術及其拆分組分對大鼠6 h內尿量作用結果顯示白術6倍劑量組和揮發油組呈現抗利尿作用，因此我們主要討論白術6倍劑量組和揮發油組Na+、K+、Cl-排出量與空白對照組和陽性對照組的差別。氫氯噻嗪為Na+-Cl-同向轉運抑制劑，主要作用于遠曲小管近端的Na+-Cl-同向轉運體，減少Na+、Cl-的重吸收，主要的利尿機制為增加尿鈉、鉀、氯等離子排泄，這一點在本實驗結果中也得到證實。白術6倍劑量對Na+、K+、Cl-排出量顯著增加，與氫氯噻嗪相比，其白術6倍量對K+排出量作用更強。揮發油組分對Na+排出量顯著增加，而K+、Cl-排出量無明顯影響，與氫氯噻嗪相比，在Na+/K+比值上作用更強。由此我們可知白術6倍量和揮發油與氫氯噻嗪對大鼠Na+、K+、Cl-排出量具有一定相似性，都能促進電解質的排泄，且揮發油能顯著增加Na+/K+比值，但白術水煎液和揮發油組分藥理作用表現為抗利尿作用而非利尿作用；這可能與白術藥理作用較多有關，雖對機體電解質具有一定促進作用，但并非通過促進電解質排泄產生利尿或抗利尿作用。以上結果我們可推斷白術的抗利尿作用并非通過影響Na+-K+-ATP酶的活性、尿液的生成和電解質的排泄而實現，可能是通過調節消化液的分泌、胃腸運動、消化道水的吸收、糞便排泄等其他間接途徑實現的。

綜上所述，本文首次對白術各拆分組分的利尿作用研究，尚未證實白術的利尿作用，相反得出白術對正常大鼠有一定的抗利尿作用，且首次研究發現白術揮發油有一定的抗利尿作用；白術抗利尿作用的相關機制尚不明確，有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：103-104.

[2] 李偉，文紅梅，崔小兵，等.白術健脾有效成分研究[J].南京中醫藥大學學報，2006，22(6)：366-367.

[3] 張奕強，許實波.白術內酯系列物的胃腸抑制作用[J].中藥材，1999，22(12)：636-640.

[4] 黃玉燕，丁昕宇，孫偉，等.白術水煎劑外用對致炎小鼠血清TNF-α含量的影響[J].北京中醫藥大學學報，2005，28(6)：57-58.

[5] 陳敏珠，張毅.白術的利尿作用[J].生理學報，1961，24(3)：227-237.

[6] 施文榮，劉艷，陳玲，等.白術燥濕利水作用的研究[J].福建中醫學院學報，2007，17(3)：29-31.

[7] 李玲輝，冉小庫，徐煜彬，等.白術組分拆分及組間差異度評價方法的建立[J].分析化學，2014，42(3)：343-348.

[8] Zhe Lin，Yan Fang Liu，Yang Qu，et al：Characterisation of oligosaccharides from Baizhu by HILIC-MS[J].J Natural Product Research，2015，29(13)：1194-1200.

[9] 王艷宏，王秋紅，夏永剛，等.麻黃化學拆分組分的性味藥理學評價[J].中國中醫藥科技，2011，18(6)：489-491.

[10] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京：人民衛生出版社，2001：1123-1124.

[11] 李森，謝人明，孫文基.茯苓、豬苓、黃芪利尿作用比較[J].中藥材，2010，33(2)：264-267.

StudyonDiureticEffectofAtractylodisMacrocephalaeRhizoma

CHEN Jing,SUNYunchao，RANXiaoku，YUANYing,DOUDeqiang*

(CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,China)

Objective:To study the diuretic effect of the Atractylodis macrocephalae rhizoma and its fractions.Methods:Multi-mode separation methods were adopted to split the components of Atractylodis macrocephalae rhizoma.The indictor of urine excretion in 6 h was used to study the diuretic effect of Atractylodis macrocephalae rhizoma and its splitted fractions in the water loaded rats.Further, the activity of Na+-K+-ATPase in red cell and renal medulla, the level of carbonic anhydrase in renal medulla and the output of Na+, K+, Cl-in urinewere measured to elucidate the related mechanization.Results:The anti-diuretic effect was observed in the high dosage of Atractylodis macrocephalae rhizoma water decoction and volatile oil fraction groups. Versus the control group, the activity of Na+-K+-ATPase in red cell and renal medulla and the level of carbonic anhydrase in renal medulla were not significantly changed in Atractylodis macrocephalae rhizoma water decoction and its fractions groups.Conclusion:The diuretic effect of Atractylodis macrocephalae rhizoma was not observed, instead, the weak antidiuretic effect was presented and it is for the first time that antidiuretic effect of Atractylodis macrocephalae rhizoma volatile oilwas found.

Atractylodis macrocephalae rhizoma; splitted fraction; dieresis

2015-07-05)

國家重點基礎研究計劃(973計劃)(2013CB531803)；2013遼寧省高等學校創新團隊課題(LT2013020)

*

竇德強，博士生導師，教授，研究方向：中藥化學；Tel：(0411) 87406497，E-mail：deqiangdou@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.005