RP-HPLC測定八珍益母湯劑兩種煎藥方法芍藥苷和阿魏酸的含量△

馮成，王碩仁，張鵬，曹俊嶺，吳愛明，婁利霞，閆彥芳，聶波*

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.北京中醫藥大學東直門醫院 中醫內科學教育部和北京重點實驗室，北京 100700；3.北京中醫藥大學東直門醫院 骨科，北京 100700；4.北京中醫藥大學東直門醫院 藥學部，北京 100700)

RP-HPLC測定八珍益母湯劑兩種煎藥方法芍藥苷和阿魏酸的含量△

馮成1，王碩仁2，張鵬3，曹俊嶺4，吳愛明2，婁利霞2，閆彥芳2，聶波2*

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.北京中醫藥大學東直門醫院 中醫內科學教育部和北京重點實驗室，北京 100700；3.北京中醫藥大學東直門醫院 骨科，北京 100700；4.北京中醫藥大學東直門醫院 藥學部，北京 100700)

目的：比較傳統砂鍋和煎藥機煎煮八珍益母湯對芍藥苷和阿魏酸含量的影響。方法：采用傳統砂鍋和煎藥機煎煮制備八珍益母湯，反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定煎液中芍藥苷和阿魏酸的含量。色譜條件：ImtaktC18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(14∶86，ν/ν)溶液；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為芍藥苷230 nm，阿魏酸322 nm；柱溫為25 ℃。結果：芍藥苷在傳統砂鍋煎液中含量略高于煎藥機煎液；阿魏酸在兩種煎液中含量相近。結論：傳統砂鍋煎煮與煎藥機煎煮八珍益母湯劑中主要有效成分含量差異不明顯。

傳統砂鍋煎煮；煎藥機煎煮；八珍益母湯劑；芍藥苷；阿魏酸；含量測定

八珍益母方由益母草、黨參、炒白術、茯苓、甘草、當歸、川芎、酒白芍、熟地黃9味中藥組成，具有益氣養血、活血調經的功能，臨床廣泛用于治療氣血兩虛兼血瘀之月經不調及多種內科疾病，療效顯著[1]。中藥湯劑是中醫臨床應用最早、最廣泛、藥效最可靠的劑型，其煎煮質量直接影響臨床療效。中藥煎藥機代替傳統砂鍋煎藥已被廣泛應用。但兩種煎藥方法對湯劑中有效成分的影響一直是人們普遍關注問題，煎煮條件對湯劑化學成分及其藥效的影響值得深入系統地研究。因此，本文選擇臨床常用的補益方劑——八珍益母湯劑為研究對象，采用HPLC法對煎藥機與傳統砂鍋煎煮制備的兩種八珍益母湯劑中的芍藥苷和阿魏酸含量進行檢測，以比較兩種煎藥方法對八珍益母方有效成分煎出的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

東華YFY-20煎藥機(北京東華原醫療設備有限責任公司)；普通砂鍋；島津LC-10Avp高效液相色譜儀(由2個LC-10ATvp輸送泵、CTO-ASvp柱溫箱、Rheodyne 7725i手動進樣閥、SPD-M10Avp紫外-可見二極管陣列檢測器、CLASS-VP色譜工作站和電腦組成)；島津AEG-45SM十萬分之一分析天平；GILSON x57356A移液管；TP 300超聲波清洗機；SIGMA 3K15臺式低溫高速冷凍離心機(西安特普訊儀器設備有限公司)；Mill-Q A10+純水機；RE-52A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；獅鼎5HB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；康樂DZF-1型真空干燥箱(上海醫用恒溫設備廠)。

1.2 材料

芍藥苷對照品、阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為10736-200631，110773-200611)；處方藥材均購自北京白塔寺藥店，經北京中醫藥大學中藥學院閆永紅教授鑒定為合格品；煎藥機煎液由中國中醫科學院廣安門醫院煎藥室制備；砂鍋煎液為北京中醫藥大學東直門醫院重點實驗室自制；85%磷酸(Fluka，HPLC級)；甲醇(MERCK，HPLC級)；乙腈(J.T.Baker，HPLC級)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 砂鍋煎液制備

將八珍益母湯劑1劑置砂鍋內，加10倍量水，浸泡30 min，武火加熱至沸，改為文火煎煮40 min，倒出煎液；藥渣加水8倍量水，武火加熱至沸，改文火煎煮25 min，合并2次煎液，過濾后，分裝，4 ℃冰箱保存備用。重復以上操作3批次，平均一劑煎液體積為650 mL。同法分別制備缺酒白芍、缺川芎和當歸的兩種陰性煎液。

2.2 煎藥機煎液制備

將八珍益母湯劑6劑混合均勻后裝入無紡布袋內，置煎藥機內，加水4200 mL，浸泡30 min后，再加3900 mL水，開始加熱。溫度升到120 ℃，壓力增至0.12 kPa停止加熱。出液包裝，棄去前2袋，按出袋順序依次編號，每袋200 mL。重復上述操作3批次。同法分別制備缺酒炒白芍、缺川芎和當歸的兩種陰性對照煎液。

2.3 對照品溶液的制備

精密量取經105 ℃五氧化二磷減壓干燥36 h的芍藥苷對照品4.94 mg，置5 mL棕色量瓶內，用HPLC級甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得芍藥苷對照品儲備液，質量濃度為0.988 mg·mL-1；精密量取經105 ℃五氧化二磷減壓干燥36 h的阿魏酸對照品10.19 mg，置10 mL棕色量瓶內，用HPLC級甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得阿魏酸對照品儲備液，質量濃度為1.019 mg·mL-1；分別精密量取400 μL芍藥苷和阿魏酸對照品儲備液，置同-5 mL棕色量瓶內，用HPLC級甲醇定容至刻度，搖勻，即得含芍藥苷和阿魏酸混合對照品溶液，質量濃度分別為0.070 94、0.081 52 mg·mL-1。

2.4 供試品溶液的制備

精密量取相當于原生藥2.6 g的八珍益母湯于雞心瓶內，置旋轉蒸發儀水浴50 ℃濃縮至約5 mL，轉移至10 mL量瓶內，逐滴加入甲醇至刻度(邊加邊振搖)，超聲25 min，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，離心(13 000 r·min-1，10 ℃，10 min)，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.5 色譜條件

色譜柱：lmtakt C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水(14∶86，v/v)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：芍藥苷為230 nm，阿魏酸為322 nm；柱溫：25 ℃。

2.6 系統適應性及專屬性試驗

分別精密量取芍藥苷對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液、缺芍藥陰性供試品溶液和缺川芎、當歸陰性供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，結果見圖1(因兩種煎液色譜圖近似，僅列煎藥機煎液樣品色譜圖)。

注：A.對照品；B、C.煎藥機煎液供試品(不同波長下)；D.缺芍藥陰性供試品；E、F.缺川芎、當歸陰性供試品(不同波長下)；1.芍藥苷；2.阿魏酸。圖1 八珍益母湯劑HPLC圖

如圖1可知，芍藥苷保留時間為19.86 min，阿魏酸保留時間為34.21 min，供試品色譜圖在對照品對應位置出現相應色譜峰，且芍藥苷、阿魏酸色譜峰分別與前后色譜峰分離良好。缺芍藥陰性供試品溶液和缺川芎、當歸陰性供試品溶液在相應位置不出現色譜峰。結果表明，系統適應性良好，其他成分對芍藥苷、阿魏酸的測定無干擾。

2.7 標準曲線的繪制

取2.3項下芍藥苷和阿魏酸對照品儲備液各10、40、100、200、600、1000 μL，置同一5 mL棕色量瓶內，加入HPLC級甲醇定容至刻度，搖勻，即得一系列含芍藥苷和阿魏酸的混合對照品溶液。分別取混合對照品溶液各10 uL，進樣測定。以對照品芍藥苷、阿魏酸含量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，計算回歸方程，芍藥苷、阿魏酸分別在0.079 04～1.976 00 μg、0.020 38～2.038 00 μg呈良好的線性關系。回歸方程分別為Y1=1 614 355X1-41 391.2，r=0.999 8(n=6)；Y2=6 196 894X2-57 151.2，r=0.999 9(n=6)。

2.8 精密度試驗

精密量取同一混合對照品溶液10 μL，重復進樣測定6次，結果峰面積RSD分別為芍藥苷1.59%，阿魏酸0.61%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩定性試驗

精密量取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、16 h注入液相色譜儀測定，峰面積RSD分別為芍藥苷1.05%，阿魏酸0.22%，表明芍藥苷和阿魏酸在16 h內穩定性良好。

2.10 重復性試驗

精密量取同一批砂鍋煎液5份，按供試品溶液制備方法平行制備5份，進樣測定。結果芍藥苷平均質量濃度為0.086 01 mg·mL-1，RSD為1.63%；阿魏酸平均質量濃度為0.017 29 mg·mL-1，RSD為1.94%，說明該樣品處理方法重復性良好。

2.11 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的砂鍋煎液6份，分為2組，按比例精密加入一定量的對照品，按照供試品溶液制備方法處理，依法測定芍藥苷和阿魏酸的含量，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

注：回收率=(測得量-樣品中量)/加入量×100%。

2.12 樣品測定結果

分別取砂鍋煎液和煎藥機煎液，按供試品制備方法處理，并按照所建立的色譜條件進樣測定，計算煎液中芍藥苷、阿魏酸含量。同時按《中華人民共和國藥典》2015版規定方法分別測定生藥白芍中芍藥苷含量和生藥當歸、川芎中阿魏酸含量。根據以上數據，計算芍藥苷和阿魏酸的提取率，同時使用SPSS16.0統計軟件，采用獨立T檢驗，分析兩組間芍藥苷和阿魏酸含量的差異，p>0.05，兩種煎煮方法獲得的芍藥苷和阿魏酸含量差異不具有統計學意義，見表2。

表2 八珍益母方煎液中芍藥苷和阿魏酸的提取率

注：提取率=煎液中指標成分含量(mg)/對應生藥中該成分含量(mg)×100% 。

3 討論

3.1 色譜條件的確定

[2-5]所采用的色譜方法，本研究嘗試乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸等多種流動相，結果乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸溶劑系統下芍藥苷和阿魏酸有不同程度的拖尾，而在乙腈-0.1%磷酸(14∶86，v/v)系統下分析時，芍藥苷、阿魏酸與前后色譜峰分離良好，故采用該溶劑系統為分析用流動相。嘗試采用梯度洗脫程序(0 min，乙腈-0.1%磷酸(14∶86)；30 min，乙腈-0.1%磷酸(15∶85)，雖能一定程度上縮短分析時間，但系統保留時間不夠穩定，阿魏酸的分離度過小。

3.2 供試品處理方法

嘗試將煎液直接經0.22 μm微孔濾膜濾過，進樣分析，發現色譜圖上雜質峰較多，芍藥苷和阿魏酸不能很好分離，且不利于色譜儀的維護。改用取煎煮液濃縮后加甲醇超聲的方法，能有效去除雜質峰，顯著改善分離效果，且有利于色譜儀的維護，加樣回收率試驗符合要求，故選用此法處理供試品。

3.3 不同煎藥方法對湯劑有效成分含量影響的比較

比較八珍益母湯兩種煎液中芍藥苷、阿魏酸的煎出率可知，芍藥苷在傳統砂鍋煎液中含量略高于煎藥機煎液，分析其原因：芍藥苷易溶于水，且結構穩定，故在兩種煎藥方法下，均得到很好的煎出;而傳統砂鍋煎煮條件下，煎煮時間較長，故芍藥苷的煎出率略高于煎藥機煎煮，但差異不具有統計學意義(p>0.05)。阿魏酸易溶于水，但結構不夠穩定，故煎煮時間長會導致其降解，而含量下降，因此，傳統砂鍋煎煮的含量略低于煎藥機煎煮。但差異不具有統計意義。在一定程度上說明，傳統砂鍋煎藥方法與機器煎藥方法對于某些水溶性且結構穩定的化學成分的煎出影響不大。

課題組曾以清熱解表代表方感冒清熱湯劑為研究對象，比較傳統煎藥和煎藥機煎藥對湯劑中有效成分含量的影響，結果顯示，在機煎液中葛根素的煎出率較高，而砂鍋液中升麻苷的煎出率較高，兩者中5-O-甲基維斯阿米醇苷的煎出率相近[6]。本試驗以補益藥代表方八珍益母湯為研究對象，比較兩種煎藥方法對芍藥苷含量的影響，結果顯示，傳統砂鍋煎液芍藥苷含量略高于煎藥機煎液，阿魏酸則略低于煎藥機煎液，但差異不明顯。分析原因，兩種煎藥方法在加熱溫度、時間、壓力等方面存在差異，產生上述不同結果涉及到中藥所含有的化學成分的溶解性、穩定性、pH值、共存的化學成分等多種復雜因素，具體選擇哪種煎藥方式、對有效成分的影響如何、是否影響臨床療效等，有待于進一步深入研究。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 李順意，蔡敏，韓鳳梅，等.高效液相色譜法測定八珍益母顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].中國中藥雜志，2001，26(9)：631-632.

[3] 馬向東.HPLC法測定八珍益母丸中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].中國藥物評價，2014，31(4)：193-195.

[4] 葛爾寧.RP-HPLC法測定不同煎煮方法下當歸芍藥湯中阿魏酸和芍藥苷的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2005，11(6)：16-17.

[5] 王文淵，龍紅萍，卜生高.HPLC同時測定六味補血顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].湖南師范大學學報(醫學版)，2008，5(1)：58-60.

[6] 龔慕辛，薛然，聶波，等.不同煎藥方法對感冒清熱湯劑質量的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20(1)：44-46.

ContentDeterminationofPaeoniflorinandFerulicAcidinBazhenYimuDecoctionPreparedwithTwoDecoctingMethodsbyRP-HPLC

FENG Cheng1，WANGShuoren2，ZHANGPeng3，CAOJunling3，WUAiming2，LOULixia2，YANYanfang2，NIEBo2*

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicineofMinistryofEducationandBeijing,DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China;3.DepartmentofOrthopaedicsDongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China; 4.DepartmentofPharmacy,DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective：To compare effects on the contents of paeoniflorin and ferulic acid in Bazhen Yimu Decoction (BYD) prepared by machine-boiling method and marmite-boiling method.Method：BYD was decocted by traditional marmite and decocting machine respectively.Then the content of paeoniflorin and ferulic acid in the decoction were determinedby RP-HPLC.Imtakt C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used with acetonitrile:0.3% phosphoric acid (14∶86) as the mobile phase, the flow rate was 1.0 mL/min, and the detection wavelengths of paeoniflorin and ferulic Acid were set at 230 nm and 322 nm with temperature at 25 ℃.Results:The content of paeoniflorin was slightly higher, and that of ferulic acid was similar in the marmite-boiling-decoction than those in the machine-boiling-decoction.Conclusion:The differences was not obvious from the contents of main effective components in the decoctions of BYD prepared by between machine-boiling method and marmite-boiling method.

Marmite-boiling；machine-boiling；Bazhen Yimu Decoction；paeoniflorin；ferulic acid; content determination

2016-04-07)

北京市教育委員會共建項目

*

聶波，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理與中藥體內代謝了；E-mail：nieboww_1977@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.023