水稻鋅指蛋白基因OsSZP載體構建、遺傳轉化及功能分析

劉　瑩,　玉曉紅,　羅曉莉,　肖力瑋,　劉永勝,　牛向麗

(1.合肥工業大學 生物與食品工程學院,安徽 合肥　230009; 2.重慶大學 生命科學學院，重慶　400044)

?

水稻鋅指蛋白基因OsSZP載體構建、遺傳轉化及功能分析

劉瑩1,玉曉紅2,羅曉莉2,肖力瑋1,劉永勝1,牛向麗1

(1.合肥工業大學 生物與食品工程學院,安徽 合肥230009; 2.重慶大學 生命科學學院，重慶400044)

文章通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術對水稻鋅指蛋白基因OsSZP的功能進行分析。定量聚合鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)分析結果表明,通過RNAi技術可獲得OsSZP表達水平明顯降低的轉基因株系。與野生型相比,OsSZP基因下調植株的秕谷率顯著增加,花粉育性降低,表明鋅指蛋白基因OsSZP對水稻雄配子發育具有調控作用。表達模式分析結果表明,OsSZP在水稻幼苗和成熟植株根中均不表達,在水稻花藥中表達水平較高。此外,OsSZP基因的表達也受溫度、光照的影響。

水稻;鋅指蛋白;RNA干擾;育性

0　引　　言

植物的生殖發育是在外部溫度、光照和內部營養、激素等信號誘導下,多個基因表達途徑相互作用的綜合結果,涉及眾多基因。在已經分離的植物開花調控和花器官發育基因中,鋅指蛋白(zinc-finger protein)基因占有重要地位。在植物中,鋅指蛋白形成一個較大的轉錄因子家族[1-2],因其具有可以結合鋅離子的指狀結構域-鋅指結構域(zinc-finger domain)而命名,依據鋅指結構域中半胱氮酸(C)和組氨酸(H)殘基的數目和位置分為C2H2、C2HC、C2C2等亞類。其中,C2H2(Cys2/His2)型成員最多,也是研究最深入的一類。鋅指蛋白中有單個或成簇出現的鋅指結構域,依賴在長期進化過程中形成的鋅指結構域的多變組合,使其不僅可以結合DNA,還可以結合RNA、蛋白質和脂類底物,甚至同一類鋅指蛋白也顯示出不同的結合特性。因此,鋅指蛋白具有調控基因轉錄、染色質重構等多種生理功能[3-4]。同時,在植物進化過程中鋅指蛋白家族成員也不斷增加,有些鋅指蛋白甚至是植物所特有的。如模式植物擬南芥有176個C2H2型鋅指蛋白成員[5];在水稻基因組中鑒定了189個C2H2型[6]、68個CCCH型鋅指蛋白候選基因[7],其中僅有部分鋅指蛋白基因的生物功能被闡明,并發現它們參與調控植物各個時期的生長發育調控、脅迫應答等[8-10]。

在擬南芥菜開花誘導中處于核心地位的CONSTANS(CO)基因編碼鋅指蛋白轉錄因子在長日照條件下激活下游基因的表達促進開花;水稻中CO的同源基因Hd1也編碼鋅指蛋白轉錄因子,但與CO不同的是Hd1在短日照條件下，激活下游基因表達而促進短日植物水稻開花[11]。文獻[12-13]在水稻中分離鑒定的鋅指蛋白轉錄因子RID1,通過調控Hd1、RFT1等下游開花調控基因來影響水稻從營養生長向生殖生長的轉化。在花粉發育方面,已發現矮牽牛有多個鋅指蛋白在花藥中特異表達，并呈現明顯的先后順序[14]。在擬南芥菜中PHD型鋅指蛋白基因MALESTERILITY1 (MS1)是雄性不育基因,其功能是調控花粉和絨氈層的發育[15]。

水稻是我國第一大糧食作物,水稻產量對保障國家糧食安全具有舉足輕重的作用。我國水稻育種以雜種優勢利用為標志的第二次“綠色革命”,使水稻產量有了前所未有的突破,而雜交水稻育種三系法、兩系法配套策略分別利用了核質互作不育系和光、溫敏不育系而得以實現。另一方面,雜種不育又是水稻秈粳亞種遠源雜種優勢利用的主要障礙。因而,育性在水稻遺傳育種研究中倍受關注[16]。

本研究分離了一個水稻鋅指蛋白基因OsSZP(Oryza sativa sterile-related zinc-finger protein),通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術下調OsSZP基因表達[17],利用農桿菌介導法轉化獲得轉基因水稻。對轉基因株系的表型分析顯示,與野生型植株相比,OsSZP下調轉基因植株花粉育性降低,表明OsSZP基因對水稻生殖發育具有調控作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料

克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector、大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α購于北京全式金生物技術有限公司;pMD18-T Vector購于TaKaRa公司;pSK vectctor由本實驗室保存;真核表達載體pHB由上海交通大學楊洪全教授實驗室構建提供[18],本實驗室保存;用于轉基因的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105 購于Clontech公司;水稻粳稻品種日本晴(Oryza sative L.ssp.japonica cv.Nipponbare)種子由本實驗室提供。

RNA提取試劑Trizol購于Invitrogen公司;反轉錄酶ReverTraAce購于Toyobo公司;高保真DNA聚合酶PrimeStar、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶XhoⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ、Pst Ⅰ、EcoRⅠ、T4連接酶購于TaKaRa公司;質粒提取試劑盒EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、瓊脂糖膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit購于北京全式金生物技術有限公司;引物設計采用Primmer Premmier 5.0軟件,由上海英駿生物技術有限公司合成。其余試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2實驗方法

1.2.1OsSZP基因編碼區擴增

根據水稻OsSZP基因序列(GenBank登錄號:AK071104)設計OsSZP編碼區擴增引物為：

5′-TCTCTCTCTAGTGAACTTGC-3′；

5′-AGGGTTCTGTATCTCCATCCAAC-3′。

從水稻日本晴葉片中提取總RNA,取1 μg總RNA合成第一鏈cDNA。聚合物鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)條件為:98 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,56 ℃ 10 s,72 ℃ 90 s,30個循環;72 ℃總延伸 5 min。PCR產物經膠回收與克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector連接,轉化DH5a感受態細胞,鑒定陽性克隆(命名為pEASY-OsSZP)送測序。

1.2.2水稻OsSZP基因表達模式分析

取野生型日本晴幼苗(生長28 d,根、莖、葉)和成熟植株(根、莖、葉、花藥)不同組織以及在不同光、溫條件下處理48 h (生長28 d植株,28 ℃，12 h光/12 h暗、10 ℃，12 h光/12 h暗、42 ℃，12 h光/12 h暗、42 ℃，24 h暗)葉片樣品,液氮研磨后提取RNA,通過逆轉錄合成第一鏈cDNA。以水稻ACTIN為內參基因(GenBank登錄號:X16280),利用半定量PCR分析OsSZP基因的表達情況。OsSZP引物為：

5′-CTCGAGGATCCTCGACTCCTTCGACGACCT-3′;

5′-AAGCTTAGGGTTCTGTATCTCCATCC-3′。

ACTIN引物為:

5′-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3′;

5′-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3′。

PCR反應條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,27個循環;72 ℃10 min (總延伸)。

1.2.3OsSZP基因RNAi載體構建

按照OsSZP基因序列設計引物,擴增用于構建RNAi載體的正、反向片段。正向片段引物為:

5′-CTCGAGGATCCTCGACTCCTTCGACGACCT-3′;

5′-AAGCTTAGGGTTCTGTATCTCCATCC-3′。

兩端分別引入XhoⅠ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點。

反向片段引物為:

5′-CTGCAGTCGACTCCTTCGACGACCT-3′;

5′-GAATTCAGGGTTCTGTATCTCCATCC-3′。

兩端分別引入Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點。

以pEASY-OsSZP為模板,分別進行正、反向片段擴增。所獲得的PCR產物連接于pMD18-T載體,連接產物轉化大腸桿菌感受態,對重組質粒進行測序。將測序正確的正向片段經Xho Ⅰ、Hind Ⅲ酶切回收連接于pSK 質粒,反向片段經Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切回收連接于已連接上述正向片段的pSK 質粒,形成正、反向重復基因片段。然后利用BamH、Pst Ⅰ將正反向基因片段整體酶切插入植物表達載體pHB,構建35S-OsSZPRNAi載體,命名為pHB-SZPRI。通過凍融法轉化農桿菌,獲得帶有pHB-SZPRI質粒的陽性農桿菌克隆,保存備用。

1.2.4水稻遺傳轉化

本實驗水稻的轉化采用農桿菌介導法[19-20]。水稻野生型日本晴成熟種子去殼,分別用75%乙醇溶液、25%次氯酸鈉溶液進行表面消毒,接種于誘導培養基中28 ℃ 下暗培養誘導愈傷組織。愈傷繼代2次后預培養4 d,用于農桿菌侵染。預培養愈傷在農桿菌菌液中侵染20 min,移入共培養基28 ℃ 下暗培養2 d,然后轉入含潮霉素的選擇培養基篩選抗性愈傷(潮霉素質量濃度依次為30、40、50 mg/L)。將抗性愈傷轉入分化培養基,10～15 d后選取分化幼苗接于生根培養基中。待幼苗生長7～10 d后移入溫室中煉苗,約21 d后移入溫室培養。

誘導培養基:NB+2 mg/L 2,4-D,pH值為5.8～5.9;共培養培養基:NB+2 mg/L 2,4-D+100 μmol/L乙酰丁香酮,pH值為5.2;篩選培養基:NB+2 mg/L 2,4-D+250 mg/L羧芐青霉素+30～50 mg/L潮霉素,pH值為5.8～5.9;分化培養基:NB+10 mg/L KT+0.4 mg/L NAA+250 mg/L 羧芐青霉素,pH值為5.8～5.9;生根培養基:1/2 MS,pH值為5.8～5.9。

1.2.5OsSZP轉基因植株鑒定

分別提取野生型、轉基因植株基因組DNA,利用pHB載體所攜帶潮霉素抗性標記基因進行PCR擴增。引物為：

5′- TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3′；

5′- GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3′。

分別取野生型、T3代RNA干涉轉基因植株葉片,液氮研磨后提取RNA,反轉錄合成第一鏈cDNA。以水稻ACTIN基因為對照,進行OsSZP基因表達水平實時定量PCR分析。OsSZP引物為：

5′- GATCCTCATTGGCCCTACCC-3′；

5′-CCCTTCCTGTACTGCGACCC-3′。

ACTIN引物為：

5′-AGTGATTGCACCACCAGAAAGA-3′；

5′-CAGGACCAGATTCATCATACTCG-3′。

反應條件如下:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s,40個循環。擴增后,65 ℃ 5 s,每個循環增加0.5 ℃,60個循環,進行溶解曲線分析。每個樣品重復3次。PCR在Bio-Rad CFX 96上運行。

1.2.6OsSZP基因RNAi轉基因植株表型分析

將所鑒定RNAi轉基因株系(Ri-1～Ri-3)與同期生長野生型植株(n=15)的株高、分蘗數、每穗粒數、秕谷率等利用SPSS 12.0軟件(P<0.05)進行測定比較。取穎花樣品經固定、染色、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟及染色,制備花粉囊組織切片。

2　結果與分析

2.1OsSZP基因克隆

高保真酶擴增OsSZP基因產物連接于pEASY-Blunt載體,測序結果與美國國家生物技術信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)登錄基因序列進行比對,確認得到OsSZP基因編碼序列。經SMART 軟件分析可知,OsSZP是C2H2型鋅指蛋白基因，在其278～300位、324～357位、362～382位和388～410位氨基酸,共有4個鋅指結構域。利用PLACE軟件,對上游序列應答元件分析結果顯示,OsSZP基因轉錄起始位點上游有花藥特異調控元件AGAAA,并有多個光調控元件,如GATA、GRWAAW、GATAA、GGGCC等。

2.2OsSZP基因表達模式分析

OsSZP基因表達模式分析結果如圖1所示。由圖1可知,OsSZP基因在野生型日本晴幼苗、成熟植株的根中均不表達;在幼苗、成熟植株的莖、葉中有表達;在花藥中表達量最高。此外,OsSZP基因在不同光、溫生長條件下,與正常生長條件(28 ℃,12 h光/12 h暗)相比,低溫(10 ℃,12 h光/12 h暗)、高溫(42 ℃,12 h光/12 h暗)處理48 h后,OsSZP表達水平均稍有降低;與光照培養相比,高溫暗培養(42 ℃,24 h暗)條件下OsSZP表達量明顯降低。

圖1　OsSZP基因表達模式分析

2.3OsSZP 基因RNAi轉基因植株鑒定

利用帶有OsSZP基因正、反向重復片段植物表達載體pHB-SZPRI的農桿菌結構如圖2a所示,通過農桿菌介導遺傳轉化方法,獲得轉基因植株。提取野生型、轉基因植株基因組DNA,利用潮霉素抗性標記基因(Hpt)序列進行PCR擴增檢測，結果如圖2b所示,由圖2b可知，鑒定轉基因為陽性株系。對野生型、3個獨立T3代轉基因陽性株系(Ri-1～Ri-3)進行OsSZP基因表達水平分析,如圖2c所示,由圖2c可知，轉基因植株中OsSZP基因較野生型明顯降低,表明獲得水稻OsSZP基因下調株系。

圖2　OsSZP基因RNAi轉基因株系鑒定

2.4轉基因植株表型分析

轉基因植株表型分析結果如圖3所示。

圖3　OsSZP基因RNAi轉基因植株表型

由圖3可看出,與同期平行種植野生型日本晴秕谷率(7.3%)相比,各轉基因株系秕谷率明顯增高,分別為68.7%、40.6%和82.8%,且OsSZP基因下調程度與秕谷率的升高基本一致。花藥組織切片顯示,OsSZP基因下調植株中同一花藥4個花粉囊發育不同步或敗育,藥室發育不全;成熟花粉形狀不規則,染色不均勻。與野生型相比,轉基因株系株高、分蘗數、每穗粒數無顯著差異。

3　結　論

本研究對含有4個鋅指結構域的C2H2型鋅指蛋白基因OsSZP進行了克隆和RNAi,所獲得OsSZP基因下調轉基因植株花粉發育異常,秕谷率顯著升高,表明OsSZP基因功能與水稻生殖發育相關。在對OsSZP進行過量表達時,獲得表達量增加0.5～2.5倍T2代轉基因株系(OX-1～OX-3),秕谷率未見明顯差異,如圖4a所示,而所得到過表達共抑制(co-suppression)株系(CS-1～CS-3)中OsSZP基因比野生型有所降低,育性下降,如圖4b所示,秕谷率較野生型(7.3%)明顯升高,分別為41.2%、56.8%、47.1%。

此外,在遺傳轉化過程中獲得的轉基因陰性株系秕谷率未見明顯變化;育性較差的OsSZP基因RNAi下調植株授以野生型花粉時可以正常結實、發苗生長,進一步表明鋅指蛋白基因OsSZP參與水稻生殖調控,對水稻雄配子發育具有負調控作用。

圖4　過表達及共抑制轉基因株系表型

在OsSZP基因下調轉基因植株的稻穗中,出現7%～15%“假粒”現象,即子房自行發育膨大形成形似糙米,其內充滿液體,沒有胚和胚乳的囊體,如圖5所示。這種假粒也出現在一些水稻雄性不育系中,被認為與雄性不育系子房孤雌發育有關,并受溫度影響,當溫度升高時假粒率也明顯增加[21]。

與其他植物相似,由于生殖發育是攸關種群繁育的重要事件,在水稻中配子發育同樣綜合內外信號進行精細復雜的網絡調控。鋅指蛋白轉錄因子作為調控網絡的重要部分,感受外部信號并在上游蛋白調控下進行轉錄表達。

圖5　OsSZP基因下調轉基因植株稻穗中的假粒現象

OsSZP基因上游有多個光調控元件,如GATA、GRWAAW、GATAA、GGGCC等,這與OsSZP基因在光、暗培養條件中表達情況及在水稻根中不表達的檢測結果相符。此外,在OsSZP基因上游有花藥特異調控元件AGAAA,以及在花器官發育中具有重要調控作用的MADS結構域蛋白[22]、AP2-like[23]和B3-like[24]蛋白的識別元件CWWWWWWWWG、CAACA。因此,可以推測OsSZP基因的表達受到上游花發育基因的調控,繼而作為轉錄因子進一步調控其下游基因的表達,最后形成相應表型。因此,研究水稻鋅指蛋白基因在生殖發育中的功能,并進一步揭示其分子機制,有助于開拓新的不育基因資源,為作物新品種培育與遺傳改良提供基礎。

[1]BROWN R S.Zinc finger proteins:getting a grip on RNA[J].Current Opinion in Structural Biology,2005,15(1):94-98.

[2]TAKATSUJI H.Zinc-finger proteins:the classical zinc finger emerges in contemporary plant science[J].Plant Molecular Biology,1999,39(6):1073-1078.

[3]LIU Liansen,WHITE M J,MACRAE T H.Transcription factors and their genes in higher plants:functional domains,evolution and regulation[J].European Journal of Biochemistry,1999,262(2):247-257.

[4]GAMSIAEGER R,LIEW C K,LOUGHLIN F E,et al.Sticky fingers:zinc-fingers as protein-recognition motifs[J].Trend in Biochemical Sciences,2007,32(2):63-70.

[5]ENGLBRECHT C C,SCHOOF H,BOHM S.Conservation,diversification and expansion of C2H2 zinc finger proteins in theArabidopsisthalianagenome[J].BMC Genomics,2004,5:39.

[6]Agarwal P,Arora R,Ray S,et al.Genome-wide identification of C2H2 zinc-finger gene family in rice and their phylogeny and expression analysis[J].Plant Molecular Biology,2007,65:467-485.

[7]WANG D,GUO Y,WU C,et al.Genome-wide analysis of CCCH zinc finger family in Arabidopsis and rice [J].BMC Genomics,2008,9:44-54.

[8]CIFTCI-YILMAZ S,MITTLER R.The zinc finger network of plants[J].Cellular and Molecular Life Sciences,2008,65:1150-1160.

[9]TAKATSUJI H.Zinc-finger transcription factors in plant[J].Cellular and Molecular Life Sciences,1998,54(6):582-596.

[11]YANO M,KATAYOSE Y,ASHIKARI M,et al.Hd1,a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice,is closely related to theArabidopsisflowering time gene CONSTANS[J].The Plant Cell,2000,12(12):2473-2484.

[12]KOZAKI A,HAKE S,COLASANTI J.The maize ID1 flowering time regulator is a zinc finfer protein with novel DNA binding properties[J].Nucleic Acids Research,2004,32(5):1710-1720.

[13]WU C,YOU C,LI C,et al.RID1,encoding a Cys Z-His2-type zinc finger transcription factor,acts as a master switch from vegetative to floral development in rice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(35):12915-12920.

[14]KAPOOR S,KOBAYASHI A,TAKATUSJI H.Silencing of the tapetum-specific zinc finger geneTAZ1 causes premature degeneration of tapetum and pollen abortion in petunia[J].The Plant Cell,2002,14(10):2353-2367.

[15]ITO T,NAGATA N,YOSHIBA Y,et al.ArabidopsisMALESTERILITY1 encodes a PHD-type transcription factor and regulates pollen and tapetum development[J].The Plant Cell,2007,19(11):3549-3562.

[16]胡駿,黃文超,朱仁山,等.水稻雄性不育與雜種優勢的利用[J].武漢大學學報(理學版),2013,59(1):1-9.

[17]FIRE A,XU S Q,MONTGOMERY M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391:806-811.

[18]MAO J,ZHANG Y C,SANG Y,et al.A role for Arabidopsis cryptochromes and COP1 in the regulation of stomatal opening[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(34):12270-12275.

[19]HIEI Y,OHTA S,KOMARI T,et al.Efficient transformation of rice (OryzasativaL.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].The Plant Journal,1994,6(2):271-282.

[20]張惠瑩,張黎,李嶸,等.西南地區4個秈稻恢復系遺傳轉化植株再生體系研究[J].合肥工業大學學報(自然科學版),2013,36(12):1511-1517.

[21]譚學林.滇型雜交水稻雄性不育系子房孤雌發育的觀察[J].云南農業大學學報,1989,4(1):82-83.

[22]黃方,遲英俊,喻德躍.植物MADS-box基因研究進展[J].南京農業大學學報,2012,35(5):9-18.

[23]MAES T,ZETHOF J,KARIMI M,et al.PetuniaAp2-like genes and their role in flower and seed development[J].The Plant Cell,2001,13 (2):229-244.

[24]LEVY Y Y,MESNAGE S,MYLNW J S,et al.Multiple Roles ofArabidopsisVRN1 in vernalization and flowering time control[J].Science,2002,297(5579):243-246.

(責任編輯閆杏麗)

Construction, genetic transformation and function analysis of a rice zinc-finger protein geneOsSZP

LIU Ying1,YU Xiaohong2,LUO Xiaoli2,XIAO Liwei1，LIU Yongsheng1,NIU Xiangli1

(1.School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2.School of Life Sciences, Chongqing University, Chongqing 400044, China)

The function of a rice zinc-finger protein geneOsSZPwas investigated by RNA interference(RNAi). The analysis results of quantitative polymerase chain reaction(PCR) and phenotype showed that the transgenic plants with significantly lowerOsSZPexpression level could be obtained by RNAi. TheOsSZPdown-regulated transgenic plants exhibited increased blasted rates and reduced pollen fertilities compared with wildtype, suggesting thatOsSZPfunctions as a regulator of male gamete development in rice. The expression pattern analysis results revealed thatOsSZPwas not expressed in roots of rice seedlings and mature plants, but showed higher level in rice anther. In addition, the abundance ofOsSZPwas also affected by temperature and light.

rice; zinc-finger protein; RNA interference(RNAi); fertility

2015-03-16；

2015-04-14

國家自然科學基金面上資助項目(30270031)

劉瑩(1992-),女,安徽六安人,合肥工業大學碩士生;

劉永勝(1964-),男,重慶市人,博士,合肥工業大學教授,博士生導師;

10.3969/j.issn.1003-5060.2016.07.024

Q943.2；S511.03

A

1003-5060(2016)07-0988-06

牛向麗(1971-),女,河南周口人,博士,合肥工業大學研究員,碩士生導師.