土荊芥揮發性化感物質對蠶豆葉表皮保衛細胞的影響

周　健， 馬丹煒， 陳永甜， 袁立娜， 黃雪婷， 瞿歡歡

( 四川師范大學 生命科學學院， 成都 610101 )

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土荊芥揮發性化感物質對蠶豆葉表皮保衛細胞的影響

周健， 馬丹煒*， 陳永甜， 袁立娜， 黃雪婷， 瞿歡歡

( 四川師范大學 生命科學學院， 成都 610101 )

化感作用是外來植物土荊芥(Chenopodiumambrosioides)成功入侵的機制之一。為了探討土荊芥揮發油的化感作用機制，該文以蠶豆(Viciafaba)葉的下表皮為材料，將表皮條孵育在分別含土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素的MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid]緩沖液中，25 ℃下光照培養30 min，采用吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙熒光染色法和Feulgen染色法，研究土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素對保衛細胞活性和細胞核形態的影響。結果表明：在土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素的作用下，蠶豆氣孔保衛細胞活性降低，細胞核出現固縮、畸形或降解等細胞凋亡特征。隨著處理劑量增加，保衛細胞活性顯著下降，核異常率顯著增加，表明土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素均對蠶豆保衛細胞具有細胞毒性，其中，揮發油毒性最大，α-萜品烯的毒性次之，對傘花素的毒性最小；Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可緩解揮發油、α-萜品烯和對傘花素對保衛細胞的毒性，提高細胞活性，這種緩解效應隨著抑制劑濃度的增加而增大。由此可見，土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素誘導蠶豆保衛細胞發生了Caspase依賴性的細胞凋亡。

土荊芥, 化感脅迫, 揮發油, 保衛細胞， 細胞凋亡

氣孔對光合作用CO2的吸收和蒸騰作用水分的喪失具有調節功能，因此，任何改變氣孔功能的因素均會影響光合作用和水分之間的關系，進而影響植物的產量(McAinsh et al，1996)。氣孔保衛細胞也是植物對外界刺激作出響應的最直接門戶，可對多種刺激做出反應(魏愛麗等，2014)，如SO2(魏愛麗等，2014；Wei et al，2013)、鋁(王毅等，2013)、砷(薛美昭等，2014)等外界環境脅迫均會誘導氣孔保衛細胞發生死亡，氣體甲醛脅迫增加了蠶豆(Viciafaba)保衛細胞中H2O2的積累，顯著降低蠶豆的氣孔導度和開度(孫慧群等，2015)。這些研究表明，氣孔保衛細胞對環境變化反應靈敏是研究環境脅迫機制的良好材料。

土荊芥(Chenopodiumambrosioides)為藜科藜屬一年或多年生芳香性草本植物，原產熱帶美洲，是我國危害極嚴重的外來入侵植物之一(徐海根等，2004)。外來植物在入侵過程中，向外界釋放化感物質抑制周圍植物生長，是其成功入侵的機制之一(Cipollini et al，2012)，而細胞毒性是許多化感物質的一個重要特性(Cipollini et al，2012)。土荊芥具有較強的化感作用(Jimenez et al，1996)，在其化感脅迫下，受體植物的根邊緣細胞數量減少，存活率下降(李安奇等，2012)；根尖分生區細胞有絲分裂指數下降，微核率和畸變率增加(胡琬君等，2011)，膜脂過氧化程度加劇，抗氧化酶活性受到抑制，細胞出現氧化損傷和細胞凋亡現象(胡琬君等，2012)。這些研究結果表明，土荊芥通過揮發途徑釋放的化感物質對周圍植物的影響很大。植物釋放的揮發性化感物質除了一部分通過淋溶進入土壤影響受體植物根系外(王朋等，2008)，大部分會釋放到空氣中作用于受體植物的地上器官，尤其是葉片。大氣中的物質主要通過葉片上的氣孔進入植物體，而目前有關土荊芥對氣孔的影響報道較少。本研究以在土荊芥入侵地廣泛種植，并且用于觀察保衛細胞氣孔活動的模式植物蠶豆(Viciafaba)(孫慧群等，2015)為材料，采用表皮分析法研究土荊芥揮發油及其兩種主要成分α-萜品烯和對傘花素對保衛細胞的影響，為揭示土荊芥揮發性物質化感作用機制提供理論依據。

1　材料與方法

1.1 材料

供體植物土荊芥于2014年9月下旬采于四川省成都市錦江區包江橋附近的荒地。采用改進后的水蒸氣蒸餾法(Singh et al，2009)提取土荊芥揮發油，用無水Na2SO4除去水分，得到淡黃色具有強烈芳香味的揮發油，測得密度為843 mg·mL-1。4 ℃保存備用。

根據文獻(魏輝等，2010；熊秀芳等，1999)報道，α-萜品烯和對傘花素為土荊芥揮發油的主要成分。經四川大學測試中心分析鑒定，供試土荊芥揮發油中，α-萜品烯和對傘花素的含量分別為151和156 mg·mL-1。α-萜品烯和對傘花素的標準品及Caspase抑制劑Z-VAD-FMK均購自成都市銳可思生化試劑公司。

受體植物蠶豆種子(成胡14#)購于成都市五塊石種子市場。

1.2 方法

1.2.1 材料培養挑選大小均一、飽滿的蠶豆種子，用0.5% KMnO4浸泡15 min，蒸餾水浸種24 h，無光照25 ℃催芽2～3 d，待露白后播種于盛有石英砂的小花盆(直徑10 cm，高度6 cm)中。置于25 ℃、光暗周期14 h/10 h的條件下培養。幼苗生長期花盆內Hoagland營養液(CaNO3·4H2O 945 mg·mL-1，KNO3506 mg·mL-1，NH4NO380 mg·mL-1，KH2PO4136 mg·mL-1，MgSO4·7H2O 493 mg·mL-1，鐵鹽溶液 2.5 mL，微量元素液5 mL，pH 6.0)保持在0.2%。

圖 1　土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素處理后蠶豆保衛細胞活性變化　a. 對照組; b. 氣孔單保衛細胞活性喪失; c. 雙保衛細胞活性喪失; d. 核裂解。Fig. 1　Viability changes in the guard cells of Vicia faba exposed to volatile oil from Chenopodium ambrosioides, α-terpinene and cymene　a. Control group; b. Lossing of the stoma single guard cell viability; c. Lossing of the stoma double guard cell viability; d. Nuclear degradation.

圖 2　土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素對蠶豆保衛細胞活性的影響　Fig. 2　Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides, cymene and α- terpinene on guard cell viabilities in Vicia faba

待蠶豆長至4周左右時取頂端完全展開的葉片，用鑷子撕取1 cm × 0.5 cm的下表皮用于脅迫處理試驗。

1.2.2 脅迫處理用二甲基亞砜(DMSO)配制揮發油、α-萜品烯和對傘花素處理母液。將10 μL揮發油用DMSO稀釋至100 μL得到0.1 μL·μL-1的揮發油處理母液。根據10 μL揮發油中α-萜品烯和對傘花素的含量，配制二者的處理母液，其終濃度分別為0.016 9和0.018 6 μL·μL-1。

取10 mL的EP管若干，分別加入5 mL表皮緩沖液[50 mmol·L-1KCl，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.1 mol·L-1Tris，10 mmol·L-12-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)，pH7.0]。試驗共設置三個處理組，即揮發油處理組、α-萜品烯處理組和對傘花素處理組，每組再分為甲、乙兩組：甲組為處理組。取配置好的處理母液2，4，6，8，10 μL(分別記為梯度1、梯度2、梯度3、梯度4、梯度5)，用DMSO補充處理液至10 μL后，再分別加入盛有MES緩沖液的EP管中。每個EP管放入6個表皮條，蓋上蓋子；乙組為緩解組。分別取10 μmol·L-1和40 μmol·L-1的10 μL Caspase抑制劑Z-VAD-FMK加入盛有MES緩沖液的EP管中，每個EP管放入6個表皮條。5 min后分別加入8 μL處理液；甲、乙均設置2個對照，甲組以緩沖液和DMSO溶劑為對照，乙組以緩沖液和8 μL處理母液為對照，甲、乙兩組的EP管均置于25 ℃下光照培養30 min。每處理重復3次。

1.2.3 指標檢測細胞活性檢測：脅迫處理結束后，采用馬丹煒等(2011)的方法略有改進。將表皮條用MES緩沖液清洗3次后，取出表皮條平鋪在載玻片上，吸干緩沖液后滴加少許AO/EB染液，避光染色5 min，用LEICA DM300熒光顯微鏡觀察保衛細胞并拍照。具有綠色熒光的為活細胞，具有橘紅色熒光的為死細胞。每個處理觀察1 000 個細胞，統計保衛細胞的存活率。

細胞核異常率檢測：脅迫處理結束后，采用Feulgen染色法染色(王金發等，2004)。MES緩沖液清洗1次后，用卡諾氏固定液(冰醋酸∶無水乙醇 = 1∶3)固定2 h，然后放入稀鹽酸中60 ℃下解離8 min，蒸餾水清洗 3 次，每次10 min。吸干水分，Schiff試劑避光染色30 min，洗掉染液，LEICA DFC450C光學顯微鏡觀察并拍照。每個處理組觀察1 000 個細胞，統計保衛細胞的核異常率。

1.3 數據統計與分析

采用SPSS17.0對數據進行處理，Duncan法對各處理組細胞存活率和細胞核形態異常率進行比較分析，Microsoft Excel 2007 作圖。

圖 3　土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素作用下蠶豆保衛細胞核形態的變化a. 對照組； b. 核固縮和錯位； c. 核拉長和固縮； d. 核畸形； e. 核降解； f. 核消失。Fig. 3　Changes in the nucleus morphology of guard cells in Vicia faba exposed to volatile oil from Chenopodium ambrosioides, cymene and α-terpinene　a. Control group; b. Nuclear pyknosis and malposition; c. Nuclear elongation and pyknosis; d. Nuclear malformation; f. Nuclear disappearance.

2　結果與分析

2.1 土荊芥揮發油及其兩種主要成分對保衛細胞活性的影響

經AO/EB染色后在熒光顯微鏡下觀察表皮條發現，對照組中大部分保衛細胞的細胞核發亮綠色熒光(圖1：a)，具有較高的活性，而處理組則隨著處理劑量增加，發出橘紅色熒光(圖1：b-c)細胞核的數目隨之增加，即喪失活性的細胞數目在增加，并且出現細胞核降解紅色熒光消失(圖1：d)的情況，說明土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素均可以誘導保衛細胞死亡。

從圖2 可以看出，與對照相比，溶劑DMSO對保衛細胞活性沒有顯著影響。土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素均導致保衛細胞活性降低。在揮發油處理組中，細胞活性隨著揮發油處理劑量增加而顯著下降(P<0.05)；α-萜品烯處理組中，處理梯度1～3，隨處理劑量的增加保衛細胞活性顯著下降趨勢(P<0.05)，但隨著處理劑量進一步增加細胞，存活率趨于穩定；對傘花素處理組中，除了處理梯度1的細胞存活率與對照組無顯著差異，其余處理均隨著處理劑量增加細胞活性逐漸下降(P<0.05)；比較3個處理組發現，處理梯度5的細胞存活率為揮發油(5.0%)<α-萜品烯(18.0%)<對傘花素(34.8%)，由此可見，土荊芥揮發油對蠶豆保衛細胞的毒性最大，α-萜品烯次之，對傘花素的毒性最小。

2.2 土荊芥揮發油及其兩種主要成分對保衛細胞核形態的影響

土荊芥揮發油及其兩種主要成分α-萜品烯和對傘花素對保衛細胞核形態具有顯著的影響。經Schiff試劑染色后，光學顯微鏡鏡檢發現，對照組保衛細胞的核位于細胞中間，形態規則(圖3：a)；而經揮發油、α-萜品烯和對傘花素處理后，保衛細胞的核形態不規則，并出現明顯的細胞程序性死亡特征如核錯位、固縮、拉長或降解(圖3：b-f)。

圖 4　土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素對蠶豆保衛細胞核形態的影響Fig. 4　Effects of volatile oil from Chenopodium ambrosioides, cymene and α-terpinene on nucleus morphology of Vicia faba guard cells

圖 5　Caspase抑制劑對土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素細胞毒性的緩解效應Fig. 5　Alleviated effects of Caspase inhibitor on the cytotoxicity of volatile oil from Chenopodium ambrosioides, α-terpinene and cymene

在土荊芥揮發油及其主要成分作用下，保衛細胞核異常率的變化如圖4所示。從圖4可見，較低處理劑量(梯度1和梯度2)，各處理組細胞核的形態異常率與對照組、溶劑對照組均沒有顯著差異。但隨著處理劑量進一步增加(>梯度3)，細胞核異常率隨之增加，并與對照呈現顯著性差異(P<0.05)。比較三個處理組的保衛細胞異常率可見，揮發油處理過的保衛細胞異常率最大，α-萜品烯次之，對傘花素最小。

綜上所述，土荊芥及其主要成分均誘導了保衛細胞核出現異常現象，可能導致了保衛細胞發生程序性細胞死亡。

2.3 Caspase抑制劑對土荊芥化感脅迫的緩解效應

圖5顯示，當處理液中加入Caspase抑制劑后，保衛細胞存活率增加，且抑制劑濃度越大，細胞活性越高。Caspase是與程序性細胞死亡密切相關的蛋白水解酶，加入Caspase抑制劑后，由土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素誘導的保衛細胞死亡現象明顯減弱，由此可以證明，土荊芥及其主要成分誘導的保衛細胞死亡屬于細胞凋亡。

3　討論

3.1 土荊芥揮發性化感物質誘導保衛細胞凋亡

細胞毒性是某些化感物質的重要特性(Babula et al，2010)，如許多入侵植物會釋放胡桃醌、白花丹素等萘醌類化感物質，這些物質導致煙草(Nicotianatabacum)BY-2 細胞發生結構、功能以及酶的變化，細胞出現類凋亡特征(Babula et al，2009)。土荊芥揮發油導致蠶豆根尖細胞DNA發生特異性降解，形成DNA-Ladder，隨著揮發油劑量增大和作用時間延長，細胞凋亡過程加劇(胡琬君等，2011)。此外，化感物質還具有明顯的遺傳毒性，導致受體細胞發生DNA損傷、基因突變、染色體畸變、有絲分裂受阻等(馬丹煒等，2015)。本研究結果表明，土荊芥揮發油及其兩種主要成分α-萜品烯和對傘花素對均具有明顯的細胞毒性，隨著三者處理劑量增加，蠶豆葉下表皮保衛細胞活性下降甚至死亡，細胞核均出現了核畸形、固縮和降解等細胞凋亡的典型特征(Van Doorn et al，2011), 保衛細胞的核異常率隨著處理劑量增加而增大。Caspase對底物的切割使細胞呈現出凋亡的一系列形態學和分子生物學特征(翟中和等，2011)，而Z-VAD-FMK是一種可以穿透細胞膜的泛Caspase抑制劑，能明顯抑制Caspase活性而減少細胞凋亡。本研究結果表明，當在處理液中加入10和40 μmol·L-1的Z-VAD-FMK溶液后，細胞存活率顯著提高，由此可見，土荊芥揮發油、α-萜品烯和對傘花素誘導蠶豆保衛細胞發生了Caspase依賴性的細胞凋亡。

3.2 土荊芥揮發油及其兩種主要成分的化感脅迫

土荊芥釋放到周圍環境中的揮發性化感物質除了少部分隨淋溶或土壤吸附進入土壤外，大部分會揮發到大氣中，作用于植物體的地上部分，尤其是葉片。根據上述分析可知，在土荊芥揮發油及其主要成分α-萜品烯和對傘花素作用下，蠶豆葉保衛細胞發生了凋亡。從進化角度來看，細胞凋亡是植物在長期的逆境中獲得的一種適應性機制。受脅迫組織通過局部細胞死亡而主動形成一道死亡細胞屏障，避免對其他組織的進一步侵害，此外，死細胞的DNA可主動降解為核苷酸，以便植物重新利用或者用來修復逆境脅迫所帶來的傷害(肖軍等，2008)。氣孔保衛細胞也是植物對外界刺激做出響應的最直接的門戶(魏愛麗等，2014)，當受到土荊芥揮發性化感物質脅迫時，保衛細胞通過凋亡以阻止這些化感物質進一步傷害葉肉組織。最大處理劑量作用下，揮發油處理組、α-萜品烯處理組和對傘花素處理組的細胞存活率分別為5.0%、18.0%和34.8%，而核異常率分別為80.2%、51.4%和37.4%，三者的化感效應強度依次為揮發油>α-萜品烯>對傘花素。植物釋放的化感物質不是單一的，化感物質之間也存在著協同、拮抗或簡單的加合作用(孔垂華等，1998)。土荊芥揮發油是由多種物質組成的混合物，本研究結果表明，與土荊芥揮發油主要成分α-萜品烯和對傘花素相比，揮發油的化感效應強度明顯較大，表明土荊芥通過揮發途徑釋放的包括α-萜品烯、對傘花素在內的多種化感物質之間可能存在著協同或加合作用。

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Effects of volatile allelochemicals fromChenopodiumambrosioideson the stoma guard cells in leaf epidermis ofViciafaba

ZHOU Jian, MA Dan-Wei*, CHEN Yong-Tian, YUAN Li-Na,HUANG Xue-Ting, QU Huan-Huan

(CollegeofLifeSciences,SichuanNormalUniversity, Chengdu 610101, China )

Chenopodiumambrosioides, an aromatic herbnative to tropical Central and South America, has become a major invasive plant in China. Allelopathy plays a crictical role in the successful invasion ofC.ambrosioides, and has an allelopathic stress on neighbor plants. To explore the allelopathy mechanism， the effects of volatile oil fromC.ambrosioides, α-terpinene and cymene on guard cell viabilities and nucleus morphology inViciafabaleaves were investigated using epidermal strips bioassay, AO/EB fluorescent staining and conventional Feulgen staining. Epidermal strips of leaves were incubated in 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer containing volatile oil, α-terpinene and cymene for 30 min at 25 ℃ in illumination incubator. The results showed that volatile oil, α-terpinene and cymene resulted in the decrease of viabilities and increase of abnormal nuclei rates in guard cell ofV.fabaleaves. The cytotoxicity on guard cells decreased successively from volatile oil to α- terpinene to cymene. The apoptosis features including nuclear pyknotic, malposition, stretch and degradation were observed in guard cell under the treatments of volatile oil, α-terpinene and cymene. However, the guard cell survival rates increased when strips were exposed to volatile oil, α-terpinene and cymene combined with different concentrations of a caspase inhibitor Z-VAD-FMK. These results suggested that the volatile allelochemicals fromChenopodiumambrosioidesinduced guard cell caspase-dependent apoptosis inViciafabaleaves.

Chenopodiumambrosioides, allelochemical stress, volatile oil, guard cells, apoptosis

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2015-04-27

2015-09-01

國家自然科學基金(31370549); 四川省教育廳項目(16ZA0056, 16ZB0058) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31370549); Deducation Office of Sichuan Province, China (16ZA0056, 16ZB0058)]。

周健(1990-),男，甘肅隴南人，碩士，主要從事細胞生物學的研究，(E-mail)1076387029@qq.com。

馬丹煒，博士，教授，主要從事植物化感作用等研究，(E-mail)danwei10ma@163.com。

Q946

A

1000-3142(2016)08-0963-06