磷脂酰膽堿組分的二維液相色譜分離

郝　麗，朱苑露，代雅楠，段　蓿，韓欣欣，譚成玉，孔　亮，李　偉

（大連海洋大學，遼寧大連　116023）

磷脂酰膽堿組分的二維液相色譜分離

郝麗，朱苑露，代雅楠，段蓿，韓欣欣，譚成玉，*孔亮，*李偉

（大連海洋大學，遼寧大連116023）

建立了以脂質體生物色譜-反相高效液相色譜的離線二維色譜分析方法模型，以磷脂酰膽堿（Phosphatidyl choline，PC）為樣品進行色譜分析。首先采用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）為流動相，流速為0.4 mL/min，以固定相脂質體液相色譜柱（Immobilized lliposomes chromatography，ILC）的一維色譜分離。二維色譜分離采用反相C18色譜柱進行分離，流速為1 mL/min。磷脂酰膽堿在固定相脂質體色譜上僅有1個保留峰，但在反相C18色譜柱上卻存在著多個保留峰。因此，由脂質體生物色譜-反相高效液相色譜組成的二維分離色譜在闡釋了生物色譜意義的同時也充分體現了二維色譜的分離優越性。

固定化脂質體色譜；二維色譜；磷脂酰膽堿

詮釋天然產物組分的關鍵在于其活性物質的闡明。近年來，在眾多重要活性成分的分離技術中，色譜法因其良好的分離效果、多變的分離模式成為分離天然產物中活性成分不可或缺的手段。常規的色譜法大多基于中藥活性成分的物理和化學性質進行分離，不可避免地存在著分離過程無法確定分離成分的藥理信息等缺陷。為此，可以利用生物色譜法來填補常規色譜的缺陷。其中，脂質體是一種理想的模擬生物膜［1］，能夠在體外模擬活性成分的跨膜運輸和吸收過程，活性成分與脂質體的結合和其被人體吸收具有很好的相關性［2］。

雖然利用固定相脂質體色譜能夠模擬活性成分與生物膜之間的相互作用，體現了活性成分在細胞膜上的穿透能力，但單純的應用固定相脂質體色譜分離活性物質亦存在著分離度低、分離效果差等不足；反相C18色譜分離具有分辨率高、分離效果好、峰容量高等優點［3］。本文將固定相脂質體色譜與反相C18色譜各自的分離優勢相互結合，建立了固定相脂質體-反相C18離線二維分離色譜，在更好地體現了活性成分生物特性信息的同時，也達到了樣品各組分間良好的分離效果。

1　試驗部分

1.1儀器與設備

Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent LC型色譜工作站，美國Agilent公司產品；硅膠（5 μm），日本Fuji公司產品；自動餾分收集器（SBS-100型自動計滴部分收集器），上海滬西分析儀器廠有限公司產品；Unitary C18型液相色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），華譜新創科技有限公司產品；Lambda35型可見-紫外分光光度計，美國PERKINELMER公司產品；TGL-16M型高速臺式離心機，湘儀離心機儀器有限公司產品；Milli-Q型超純水凈化儀，美國Millipore公司產品；西盟凍干機，美國西盟國際儀器有限公司產品。

蛋黃卵磷脂（PC），日本東京化成工業株式會社產品；磷脂酰膽堿，購自美國sigma科技有限公司；乙腈為色譜純，百靈威科技有限公司產品；甲醇、異丙醇均為色譜純，山東蜀王實業總公司產品；磷酸鹽。緩沖溶液：50 mmol/L的Na2HPO4和NaH2PO4溶液，現用現配。

1.2試驗條件與方法

1.2.1ILC色譜柱的制備

磷脂涂覆法并加以改進制備ILC固定相：將3 g硅膠置于20%的鹽酸溶液中回流后，用大量的蒸餾水沖洗至中性。在120℃條件下真空干燥過夜，備用。取1.5 g的蛋黃卵磷脂并用30 mL的氯仿溶解，加入預先活化的硅膠3 g，旋轉蒸發除去有機溶劑。加入50×10-12mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，靜置溶脹4 h，裝柱前用PBS緩沖液洗滌，以轉速3 000 r/min離心3次，除去未固載的卵磷脂。采用pH值7.4的PBS緩沖液（無NaCl）為勻漿液，在30 MPa的壓力下將預先制備的脂質體固定相裝入不銹鋼柱管中即可。

1.2.2ILC色譜柱固定化磷含量的測定

利用卵磷脂中磷含量來表征硅膠表面固定化脂質體的含量，其中磷含量的測定方法采用水中總磷含量的測定方法。將未溶脹的涂覆硅膠用超純水溶脹4 h，干燥后稱質量，于濃硫酸中回流硝化，并用超純水洗滌剩余的硅膠，取硝化液定容后測定。

1.2.3固定相脂質體柱色譜條件

自制I.D.4.6 mm×150 mm脂質體色譜柱；流動相：50mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液；流速：0.4 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：常溫；檢測波長：208 nm。

1.2.4餾分收集

將經過固定相脂質體色譜檢測分離的樣品用自動餾分收集器進行收集，將每60 s的餾分收集在1根餾分收集管中。將收集后的餾分進行凍干濃縮，并以不同時間段收集的餾分為第二維反相C18色譜分析的樣品，進行分析。

1.2.5反相C18色譜條件

反相C18色譜柱；流動相：甲醇∶乙腈∶異丙醇（80∶10∶10）；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：常溫；檢測波長：208 nm。

2　結果與討論

2.1涂覆法制備ILC色譜柱中磷含量的測定

采用樣品中總磷含量的測定方法，以純水作為參比，于882 nm下測得的吸光度為縱坐標、以相應的磷酸鹽質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

磷含量的標準曲線見表1。

表1　磷含量的標準曲線

測得脂質體中的吸光度為0.768，故所測的樣本質量濃度為0.62 mg/L，250 mL中所含磷為0.155 mg，則0.725 g硅膠上吸附的磷為0.155 mg，硅膠上的磷含量為0.214 mg/g。

2.2磷脂酰膽堿在ILC色譜柱上的分離情況

磷脂酰膽堿在ILC色譜柱上的分離圖譜見圖1。

圖1　磷脂酰膽堿在ILC色譜柱上的分離圖譜

由圖1可知，磷脂酰膽堿（PC）在ILC色譜柱上存在保留峰，且只有1個保留峰a。ILC色譜柱是模擬生物細胞膜的脂質體結構，在ILC色譜柱上有保留的成分皆可視為細胞膜通透性的成分。由此可知，在圖譜上保留時間長的組分與脂質體的相互作用強，其疏水性強，則與細胞膜的相互作用也可能就強。磷脂酰膽堿（PC）雖然在ILC上只有1個保留峰，但其保留時間長，可知其與脂質體固定相之間存在著相互作用，進而可推斷磷脂酰膽堿進入到人體之后與人體細胞膜之間存在著一定的相互作用。由此，利用一維的ILC色譜柱模擬細胞膜環境來判定磷脂酰膽堿的生物特性。但由于生物模擬色譜ILC色譜柱存在著分離效果低的不足，故進行第二維色譜分離的分析。

2.3磷脂酰膽堿在反相C18色譜柱上的分離

二維反相色譜分離磷脂酰膽堿的單組分色譜見圖2。

與一維液相色譜分離相比，系統的分辨率顯著提高。圖2中是對磷脂酰膽堿其中的1個組分進行的反相液相分離結果，在固定相脂質體一維色譜中只分離出了1個峰，在反相液相色譜中1個組分分離出了至少8個峰，體現了反相液相色譜的高分辨率。

二維反相色譜對磷脂酰膽堿全部組分的分離色譜見圖3。

圖2　二維反相色譜分離磷脂酰膽堿的單組分色譜

圖3　二維反相色譜對磷脂酰膽堿全部組分的分離色譜

由圖3可知，與固定相脂質體色譜的分離結果相對比，反相液相色譜分離結果中出峰數達186個，峰容量為744個，經過二維的反相液相色譜分離，圖譜中相互重疊的譜峰較少，譜峰間的分離度更高，為下一步的試驗分析提供了有利條件。

2.4二維反相對磷脂酰膽堿組分的光譜分析

磷脂酰膽堿組分的紫外光譜見圖4，未知物質的紫外光譜見圖5。

由圖2的試驗結果中對磷脂酰膽堿的組分進行光譜分析可知，由于磷脂酰膽堿的物質結構特殊，其紫外光譜的吸收較弱，幾乎只存在末端吸收，如圖4所示。但在對圖2中的各個峰進行光譜分析中得到，在7.22 min時出的峰是b3的光譜圖，與其他峰的光譜圖有所不同，如圖5所示。其最大吸收波長于234 nm處，尚不知其具體信息，有待進一步研究。

圖4　磷脂酰膽堿組分的紫外光譜

圖5　未知物質的紫外光譜

3　結論

本文以磷脂酰膽堿為研究對象，建立了固定相脂質體-反相C18離線二維色譜的分離方法。利用固定相脂質體色譜來模擬細胞膜磷脂雙分子層的環境，給出了活性成分的生物信息；且將在與固定相脂質體相互作用的組分進行了二維反相C18分離，給出了活性成分的化學色譜信息，充分的體現了固定相脂質體-反相C18二維色譜的生物特性及分離特性，為今后在天然產物生物活性成分的分離提供了可能。

［1］盛亮洪，李睿巖，李萍，等.固定化脂質體色譜研究中藥復方的細胞膜通透性成分及其質量控制 ［J］.分析化學，2004（12）：1 595-1 598.

［2］何麗姍，徐斌，王光忠，等.復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜相互作用的研究 ［J］.時珍國醫國藥，2010（4）：804-806.

［3］唐濤，張維冰，李彤，等.六味地黃丸組分的二維液相色譜分離 ［J］.分析化學，2010（12）：1 767-1 771.◇

Analysis of the Phosphatidyl Cholines from Halichondria Rugosa Cell Membrane by Off-line Two-dimensional Liquid Chromatography

HAO Li，ZHU Yuanlu，DAI Ya'nan，DUAN Xu，HAN Xinxin，TAN Chengyu，*KONG Liang，*LI Wei
（Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023，China）

In this paper，phosphatidyl cholines（PCs） in Halichondria Rugosa Cell Membrane are analyzed by the model of immobilized liposomes chromatography（ILC） -RP-HPLC（Off-line two-dimensional liquid chromatography） .Research has revealed that PC retained peaks on liposome chromatography stationary phases and separate well on the RP-HPLC C18.Using established PC model the phospholipid compounds of the marine sponge cell membrane is validation.The results show that he main components of cell membrane are carbohydrates，DNA and proteins have been removed by the first dimensional chromatography（ILC），and the PCs can be separated by the second dimensional chromatography（RP-HPLC）quickly.

PCs；ILC；PC

Q545+.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.08.017

1671-9646（2016）08a-0056-03

2016-05-20

海洋局公益性行業科研專項（201005024-3，201205022-7）。

郝麗（1989— ），女，碩士，研究方向為分析化學。

孔亮（1970— ），男，博士，教授，研究方向為分析化學。

李偉（1964— ），男，博士，教授，研究方向為生物化學。