5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮對囊性纖維化跨膜轉運調節因子的激活作用

孫亮

（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連116081）

5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮對囊性纖維化跨膜轉運調節因子的激活作用

孫亮

（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連116081）

囊性纖維化跨膜轉運調節因子（CFTR），是一種受cAMP依賴的氯離子通道蛋白。CFTR在哺乳動物呼吸道和胃腸道粘膜等多種與分泌和吸收相關的上皮細胞內廣泛表達，對上皮細胞的液體轉運、鹽類運輸和離子濃度調節等具有重要的作用。CFTR功能障礙可能會引起諸如習慣性便秘等多種疾病。本實驗利用細胞熒光淬滅方法測定了小分子黃酮類化合物5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮對CFTR具有激活作用，為以CFTR作為分子靶標，用5,7,3’,4’-四甲氧基黃酮治療CFTR相關疾病奠定了理論基礎。

CFTR；5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮；激活劑；便秘

5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮（5，7，3’，4’-Tetramethoxyflavone，TMF）屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物廣泛存在于自然植物中，有抗腫瘤、抗炎等生物活性[1]。近年來發現，許多天然小分子黃酮類化合物能夠用來治療CFTR功能障礙引起的多種疾病。囊性纖維化跨膜轉運調節因子（CFTR）在人和動物中均有表達，尤其在具有分泌與吸收功能的組織中表達并扮演重要功能，如腸道、呼吸道等[2]。該實驗轉染了野生型CFTR和鹵族元素敏感熒光蛋白的大鼠甲狀腺上皮細胞對囊性纖維化跨膜轉運調節因子的激活作用。

1 TMF對CFTR激活作用

1.1 TMF對CFTR氯離子通道具有激活作用

首先利用細胞熒光淬滅模型測定了TMF對野生型CFTR氯離子激活作用。實驗時，先用100nM的Forskolin（FSK）使細胞內的cAMP濃度達到正常生理水平，然后加入50μL不同濃度的待測化合物，利用Fluostar熒光儀進行細胞熒光檢測，結果如圖1所示。

圖1 細胞熒光檢測結果

圖1表明，TMF能夠以劑量依賴的方式激活野生型CFTR氯離子通道，最大激活濃度為200μM。

1.2 TMF對CFTR氯離子通道激活作用的特異性分析

已有研究表明，CFTRinh-172和GlyH-101是CFTR的特異性抑制劑。因此，檢測在不同梯度的CFTRinh-172和GlyH-101存在下，TMF對野生型CFTR氯離子通道活性的影響，實驗結果如圖2所示。

圖2 TMF對野生型CFTR氯離子通道活性的影響

由圖2可見，兩種抑制劑均能夠有效抑制TMF對野生型CFTR氯離子通道的激活作用,且TMF對CFTR的激活作用與特異性抑制劑的濃度成正相關。

1.3 TMF對CFTR氯離子通道激活作用的動力學和可逆性分析

動力學和可逆性分析通過Fluostar間斷的時間測定，來判斷TMF發揮藥效及通道開放與時間的關系。動力學實驗中，待細胞長滿后，棄掉培養基，用含鈣鎂離子的PBS清洗3次，馬上加入TMF，使其終濃度達到最大激活濃度200μM，不需要孵育，直接設置特定時間檢測點進行測定，實驗結果如圖3所示。

圖3 TMF對CFTR氯離子通道激活作用的動力學和可逆性的影響

圖3表明，TMF對CFTR氯離子通道的激活作用具有時間依賴性，10min后能達到最大激活效果。可逆性分析實驗中，加入藥物后將細胞在培養箱中孵育15min，將溶液甩掉加入含鈣鎂離子的PBS后，立刻測定，結果表明，在洗脫30min后，TMF對CFTR通道的激活作用完全消失。以上所有實驗結果說明，TMF對CFTR通道的激活作用具有快速、可逆的特點。

1.4 TMF對CFTR氯離子通道激活作用的機制分析

機制分析實驗中用到了幾種CFTR特異性激活劑。為了探討其激活機制，檢測了在不同濃度FSK存在條件下，TMF對CFTR氯離子通道的作用，實驗結果如圖4所示。

圖4 TMF對CFTR氯離子通道的作用影響

從圖4實驗結果表明，TMF對CFTR氯離子通道的激活作用依賴于FSK。隨著FSK濃度的增加，激活作用增強；在不存在FSK情況下，高濃度的TMF仍能激活該通道。

相加效應實驗中用到了IBMX和FSK，并設置了陰、陽性對照。結果表明，FSK和IBMX最大限度地激活該通道時，TMF仍能進一步促進CFTR氯離子通道開放，即TMF對該氯離子通道的激活與FSK和IBMX存在顯著的相加作用。

同時，分析TMF與GEN的協同作用。在5μM FSK和50μM GEN同時存在時，TMF不能進一步激活CFTR氯離子通道的開放，以及不存在協同作用。以上所有實驗研究結果表明，TMF是通過提高CFTR磷酸化水平和直接與CFTR蛋白作用改變其構像兩種途徑發揮激活作用的。

1.5 TMF對小鼠結腸短路電流分析

TMF對CFTR小鼠結腸短路電流實驗中，用到了吲哚美辛和阿米洛利。吲哚美辛主要是為了抑制前列腺合成酶活性；阿米多利主要是抑制鈉離子通道的影響，防止鈉離子轉運對實驗結果的影響。當電流達到穩定后，分別于結腸粘膜側和漿膜側按濃度梯度加入TMF，當電流達峰值后，于粘膜側加入CFTRinh-172。實驗結果表明，無論是在粘膜側還是漿膜側，TMF均能顯著促進跨小鼠結腸粘膜的短路電流，且這種激活作用呈現劑量依賴的關系。當加入CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172后，粘膜側和漿膜側被激活的短路電流均能被完全抑制。

2 結論

CFTR廣泛存在于與吸收和分泌相關組織的上皮細胞頂膜上，如消化道。CFTR氯離子通道的功能障礙能夠引起多種疾病。有研究表明，上皮細胞氯離子轉運障礙可以導致腸液粘稠，水及電解質會被過渡吸收，致使糞便中水分含量減少進而引起習慣性便秘，激活CFTR氯離子通道能夠促進腸道液體的分泌進而能夠治療習慣性便秘。本研究中的黃酮類化合物TMF在離體實驗中顯示，能夠刺激小鼠結腸粘膜短路電流的提升，也就是說能夠刺激腸道氯離子跨CFTR通道轉運。因此，CFTR也可能是TMF黃酮類化合物治療習慣性便秘的靶點。

5，7，3'，4'-tetramethoxy-flavonoid on the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Activation Factor

Sun Liang
(College of Life Science, Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116081)

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), is a cAMP-dependent chloride ion channel protein, CFTR is widely expressed in the epithelial cells of the respiratory tract, gastrointestinal tract and other secretory and absorptive cells, it has an important role in the liquid transport, salt transport and ion concentration regulation of epithelial cells. CFTR dysfunction may cause a variety of diseases, such as habitual constipation. This experiment using cell fluorescence quenching quenching method for the determination of small molecules of flavonoid compounds 5, 7, 3 ', 4' - tetramethoxy flavone on CFTR has activation, to CFTR as target molecules. 5,7,3 ', 4' - tetramethoxy flavone for CFTR related diseases has laid a theoretical basis.

CFTR; 5,7,3 ', 4'- tetramethoxysilane flavonoids; Activator; Constipation

X173

A

2096-0387（2016）02-0017-03

孫亮（1990-），男，遼寧葫蘆島人，碩士研究生，研究方向：氯離子通道化學生物學。

[1]王曉,吳龍火,黃曉平,等.黃酮類化合物的抗癌機制[J].中國民族民間醫藥,2009,18(22):1-3.

[2]Vergani Paola, Lockless Steve W, Nairn Angus C, et al. CFTR channel opening by ATP-driven tight dimerization of its nucleotide-binding domains[J]. Nature, 2005, 433(7028):876-880.