IL—17體外促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)髓母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)抑制作用

孫安　周慿　花緯

[摘要]目的研究在脾細(xì)胞抗髓母細(xì)胞瘤的免疫過(guò)程中，IL-17所起的免疫調(diào)節(jié)功能。方法將小鼠脾臟取得的脾淋巴細(xì)胞在不同濃度的IL-17下與髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株共培養(yǎng)，以Daoy細(xì)胞株單獨(dú)培養(yǎng)組作為對(duì)照，用二苯基溴化四氮唑藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞毒性效應(yīng)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組Daoy細(xì)胞株和脾細(xì)胞共培養(yǎng)組在不同濃度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）條件下細(xì)胞抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且IL-17在一定濃度范圍內(nèi)（20～80ng/mL），IL-17濃度越高，髓母細(xì)胞瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率越大。此外且隨著時(shí)間的增加，各組腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也均有增加。結(jié)論IL-17在一定濃度范圍內(nèi)能增加小鼠脾細(xì)胞對(duì)髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，且在一定時(shí)間段內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，各組腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也均有增加。

[關(guān)鍵詞]髓母細(xì)胞瘤；IL-17；Th17細(xì)胞；MTT法；細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

[中圖分類(lèi)號(hào)]R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2016）05-30-04

髓母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤之一，惡性程度高，不但手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，還可沿蛛網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)移到腦脊髓和腦室各處，治療困難，在惡性腫瘤的治療新方法的探索中，目前腫瘤的免疫治療也越來(lái)越被重視，本研究探討在脾細(xì)胞抗髓母細(xì)胞瘤的免疫中，IL-17所起的免疫調(diào)節(jié)功能。

1材料與方法

1.1一般材料

細(xì)胞株：髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；采用含10%胎牛血清FBS（上海啟凡生物科技有限公司，貨號(hào)：1099141）、105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素（上海啟凡生物科技有限公司，貨號(hào)：15140122）的MEM培養(yǎng)液（GIBCO公司，貨號(hào)：11095-072），置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱（Thermo公司，型號(hào)：3111）內(nèi)培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2小鼠脾淋巴細(xì)胞制備

Balb/c雄性小鼠由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，取12只6周齡的小鼠，通過(guò)脫頸椎處死，在無(wú)菌條件下手術(shù)取脾，用Hanks液洗滌1次后，置于200目金屬網(wǎng)上進(jìn)行研壓碾磨過(guò)濾，收集網(wǎng)下脾細(xì)胞懸液。濾過(guò)的脾細(xì)胞以1000r/min離心5min，棄上清液，加紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，反復(fù)洗滌后，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（GIBCO公司，貨號(hào)：31800-022），調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁷/mL。加入ConA至3mg/mL，置于37℃，5%CO：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法進(jìn)行體外細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組以1×10⁵/mL髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株為靶細(xì)胞，1×10⁶/mL小鼠脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，混合后接種到96孔板，每組4個(gè)復(fù)孔，除對(duì)照組外，各組共培養(yǎng)液加入不同濃度的IL-17（ProSpec公司，貨號(hào)：CYT-640）；以未加入脾淋巴細(xì)胞的單純髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株為對(duì)照組。各組均置于37℃，5%CO₂孵箱內(nèi)共培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h后，加入5mg/mL的MTT溶液（Duchefa公司，貨號(hào)：P215600）20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清終止培養(yǎng)；每孔加入DMSO 200μL，37℃振蕩10min，在酶標(biāo)儀（Thermo公司，型號(hào)：Multiskan FC）490am處測(cè)各孔光吸收度（OD），計(jì)算各組細(xì)胞的殺傷率。殺傷率=[（對(duì)照組平均0D490值一實(shí)驗(yàn)組平均OD490值）/對(duì)照組平均OD490值]×100%。結(jié)果見(jiàn)表1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及S-N-K法檢驗(yàn)。所有的變量均以（x±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 IL-17可增加脾淋巴細(xì)胞對(duì)髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用

髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株和小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，用MTT法測(cè)定未加入IL-17和加入不同濃度的IL-17的各組的體外細(xì)胞殺傷活性。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)24h、48h和72h各組生長(zhǎng)抑制率用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素反差分析，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1：顯示不同濃度IL-17組的細(xì)胞抑制率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（24h，F(xiàn)=1327，P<0.01；48h，F(xiàn)=2198，P<0.01：72h，F(xiàn)=1290，P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行S-N-K法檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Daoy細(xì)胞株+脾細(xì)胞+不同濃度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）各組的細(xì)胞抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（注：S-N-K法檢驗(yàn)SPSS16.0軟件僅在無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義組顯示P值）。且IL-17在20～80ng/mL范圍內(nèi)，髓母細(xì)胞瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率越隨著IL-17濃度的增高而增加（表1，圖1）。

2.2 IL-17對(duì)脾淋巴細(xì)胞的促進(jìn)作用與時(shí)間成正比

對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的Daoy細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行單因素反差分析及S-N-K法檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各組在不同共培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（根據(jù)IL-17濃度分組：0ng/mL，F(xiàn)=947，P<0.01；20ng/mL，F(xiàn)=67，P<0.01；40ng/mL，F(xiàn)=273，P<0.01；60ng/mL，F(xiàn)=79，P<0.01；80ng/mL，F(xiàn)=11，P<0.01；100ng/mL，F(xiàn)=18，P<0.01），并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨著時(shí)間的增加而增加，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

3討論

髓母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤之一，惡性程度高，由Bialy和Cushing首先發(fā)現(xiàn)并命名。髓母細(xì)胞瘤不但手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，還可沿蛛網(wǎng)膜下腔轉(zhuǎn)移到腦脊髓和腦室各處，治療困難，是現(xiàn)代神經(jīng)外科的治療難題之一。此外髓母細(xì)胞瘤多位于四腦室內(nèi)，容易與腦干粘連，導(dǎo)致手術(shù)全切困難。并且手術(shù)后患兒多需要進(jìn)行化療和全腦脊髓放療，但兒童對(duì)放、化療的耐受差，并且放、化療還會(huì)影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育，因此有必要尋找新的治療方法治療髓母細(xì)胞瘤。在髓母細(xì)胞瘤的治療新方法的探索中，目前腫瘤的免疫治療也越來(lái)越被重視。

Th17細(xì)胞的概念在近年來(lái)被提出，是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)CD4*T細(xì)胞，因?yàn)檫@一類(lèi)T細(xì)胞亞群以產(chǎn)生白介素IL-17（Interleukin-17）為特點(diǎn)，被命名為T(mén)h17細(xì)胞（也叫輔助性T細(xì)胞17亞群或產(chǎn)生IL-17的T輔助細(xì)胞，T helper17cell or IL-17-producing T helper，Th17），Th17細(xì)胞產(chǎn)生的最重要的效應(yīng)因子是IL-17，IL-17具有強(qiáng)烈促炎癥作用，其受體在體內(nèi)表達(dá)廣泛。

IL-17能夠刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞產(chǎn)生白介素IL-6、IL-8、INF-gamma、G-CSF等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的作用還可有助于CD8+T細(xì)胞和DC細(xì)胞趨化積聚，引起局部組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和腫瘤組織破壞。目前已有研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞與IL-17與前列腺癌、髓母細(xì)胞瘤、卵巢癌等腫瘤均有一定在關(guān)系。

四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的常用方法。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)了與脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制情況，發(fā)現(xiàn)IL-17（20～100ng/mL），可增加脾淋巴細(xì)胞對(duì)共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；并且在一定時(shí)間范圍內(nèi)（24～72h），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Daoy細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率也增加。并且我們發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)（20～80ng/mL），隨著IL-17的濃度增加，脾淋巴細(xì)胞對(duì)髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用也增強(qiáng)。

近年來(lái)在研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在抗腫瘤免疫中也起了重要的作用。甚至Th17與部分腫瘤疾病臨床預(yù)后相關(guān)，可能成為某些腫瘤治療的篩選指標(biāo)和療效及預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。在黑素瘤和纖維肉瘤中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞具有增強(qiáng)抗腫瘤免疫的功能。Th17細(xì)胞可加強(qiáng)腫瘤組織中的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和DC細(xì)胞在腫瘤中的浸潤(rùn)，激活腫瘤組織特異的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能。

而IL-17是Th17細(xì)胞在主要效應(yīng)因子，Th17細(xì)胞通過(guò)IL-17發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)在IL-17缺陷的小鼠更易發(fā)生肺黑色素瘤，用分泌IL-17的T細(xì)胞治療可有效減小腫瘤的發(fā)生幾率。更重要的是，在IL-17的輔助下，Th17細(xì)胞表現(xiàn)出比Th1細(xì)胞更強(qiáng)的治療功效，使用Th17細(xì)胞治療可有效激活腫瘤特異性的CD8*T細(xì)胞。Th17細(xì)胞還能召集樹(shù)突狀細(xì)胞聚集到腫瘤組織中。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-17在髓母細(xì)胞瘤在抗腫瘤免疫中也起了一定在作用，其中在作用機(jī)制還有待于我們?cè)诮窈蟮墓ぷ髦羞M(jìn)一步探索。

在一定濃度范圍內(nèi)（20～80ng/mL），IL-17可增加脾淋巴細(xì)胞對(duì)髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，并且在一定時(shí)間范圍內(nèi)（24～72h），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脾淋巴細(xì)胞對(duì)Daoy細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率也增加。