糖化白蛋白酶法測定試劑研制與評價

連國軍，潘利琴，李寶青，陳青松

（1.溫州醫科大學　環境與公共衛生學院，浙江　溫州　325035；2.溫州市人民醫院　檢驗科，浙江　溫州325000；3.溫州醫科大學附屬第二醫院　檢驗科，浙江　溫州　325027；4.浙江夸克生物科技有限公司，浙江　紹興　312500）

?

·技術與方法·

糖化白蛋白酶法測定試劑研制與評價

連國軍1，潘利琴2，李寶青3，陳青松4

（1.溫州醫科大學環境與公共衛生學院，浙江溫州325035；2.溫州市人民醫院檢驗科，浙江溫州325000；3.溫州醫科大學附屬第二醫院檢驗科，浙江溫州325027；4.浙江夸克生物科技有限公司，浙江紹興312500）

目的：研發糖化白蛋白（GA）酶法測定試劑并進行方法學評價。方法：利用特異性的蛋白酶（PR）在3 min內裂解GA并釋放出糖化氨基酸，然后利用酮胺氧化酶進行氧化并釋放出過氧化氫，過氧化氫經Trinder’s反應顯色后，與同樣處理的標準溶液比較求得GA含量。結果：該試劑批內、批間不精密度（CV）分別為0.84%～1.88%和1.14%～2.35%；線性范圍為1.3～1 200 μmol/L，血清樣本2～16倍稀釋范圍與原倍血清的百分偏差在99.3%～108.6%之間，平均回收率為101.8%；血清中膽紅素＜35 mg/dL，甘油三酯（TG）＜750 mg/dL，血紅蛋白＜200 mg/dL，膽汁酸＜8 mg/dL，尿酸＜33 mg/dL，葡萄糖＜1 800 mg?dL-1，維生素C 15 mg/dL，EDTA?K22.5 mg/dL，肝素鈉80 U/L，枸櫞酸鈉8.0 mg/dL，對550 μmol/L GA的檢測干擾＜±5%。與日本ASAHI公司提供的GA測定試劑方法進行比較，回歸方程及相關系數分別為Y=0.9991X+ 0.0809，r=0.9958；試劑置4 ℃開蓋儲存至少穩定30 d，置4 ℃加蓋儲存至少穩定12個月。結論：GA酶法測定試劑精密度良好，線性范圍寬，稀釋準確性滿足臨床需要，回收率較高，抗干擾能力較強，與進口試劑相關性好，具有推廣應用價值。

糖化白蛋白；酶法檢測；試劑

糖化白蛋白（glycated albumin，GA）是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的產物，即血清白蛋白的賴氨酸殘基上的ε-氨基基團被糖化。GA半衰期較短，測定GA的濃度可有效反映患者過去2～3周內平均血糖的水平，并不受臨時血糖濃度波動的影響，因此，測定GA可更靈敏、更確切地反映較短期內糖尿病的控制程度［1-4］。目前國內臨床主要應用日本ASAHI公司推出的酮胺氧化酶法檢測試劑進行GA含量測定，該測定試劑無需調配即可直接使用，置2～8 ℃保存可穩定12個月，但該檢測試劑依賴進口、價格昂貴，限制了其在臨床的進一步推廣應用。本研究參考有關文獻［5-7］，在國內率先建立了酮胺氧化酶法測定GA的新方法，該法首選利用特異性的蛋白酶（PR）在3 min內裂解GA并釋放出糖化氨基酸，然后利用酮胺氧化酶進行氧化并釋放出過氧化氫，過氧化氫經Trinder’s反應顯色后，與同樣處理的標準溶液比較求得GA含量。依據該方法研發的液體即用型GA檢測試劑，可應用于目前廣泛使用的各類型全自動生化分析儀，方法快速、準確，具有臨床推廣應用價值，報告如下。

1　材料和方法

1.1材料 收集溫州醫科大學附屬第二醫院檢驗科40份健康體檢者臨床血液標本每份5 mL作為檢測對象，并另選男女各90名體檢合格成年人，年齡18～60歲，空腹靜脈采血5 mL，共采集180份血清標本用于參考值測定；GA校準品：同時期收集肝功能正常，HBsAg陰性，無脂濁、黃疸、溶血的健康體檢者的新鮮血清200份，混勻，3 000 r/min離心30 min，取上清，每瓶1 mL分裝，凍干，使用時每瓶加去離子水1 mL復溶，用HPLC法定值［8］。試劑I：含pH 7.5 Tris-HCl 50 mmol/L緩沖液、20 KU/L PR （XXVI I）、1.0 mL/L TritonX-100、5 mmol/L CaCl2、2 g/L聚乙二醇6 000、2.0 mmol/L 4-氨基安替比林、球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑、適量穩定劑；試劑I I：含pH 7.5 Tris-HCl 50 mmol/L緩沖液、30 KU/L酮胺氧化酶、50 KU/L過氧化物酶、2.0 mmol/L TOOS、1.0 mL/L TritonX-100、適量穩定劑。所用試劑從上海國藥采購，純度為分析純，水為去離子水。UV-2201紫外可見分光光度計（日本島津株式會社），OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀（日本OLYMPUS光學株式會社），pHS-3C酸度計（上海雷磁分析儀器廠）。

1.2方法

1.2.1全自動生化分析儀參數：反應類型：雙波長終點法；波長：（主）550 nm/（次）700 nm；反應溫度：37 ℃；樣品5 μL加試劑I 200 μL，反應3～5 min后讀取第1點吸光度A1，然后加試劑II 50 μL繼續反應5 min讀取第2點吸光度A2，計算ΔA=A2-A1，與標準比較后定量。計算過程由儀器自動計算完成。

1.2.2精密度評價：依據美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）EP15-A2［9］文件所提供方案，用本法試劑分別測定低、中、高3份混合血清樣本，1 d內連續測定20次用于計算批內不精密度（CV），每天測定1次、連續測定12 d用于計算批間CV。

1.2.3線性范圍評價：用0.9%氯化鈉溶液（B）和一份高濃度混合血清（H），按0.9B∶0.1H、0.8B∶0.2H、0.7B∶0.3H、0.6B∶0.4H、0.5B∶0.5H、0.4B∶0.6H、0.3B∶0.7H、0.2B∶0.8H、0.1B∶0.9H、1.0H的比例，配成10個濃度梯度的混合血清，其預期濃度按公式X=（CH×VH）/（VB+VH）進行計算。測試時按照低濃度到高濃度的順序對每個標本各測定5次，按照CLSI EP6-A文件［10］提供的方案檢查數據，以測定值為Y、預期濃度為X，繪制校準曲線，求得線性方程和相關系數r。

1.2.4最低檢出限（LOD）和最低定量限（LOQ）驗證：通過重復10次檢測空白溶液獲得的空白值和標準差s來估計LOD和LOQ。計算公式為：LOD=+3s，LOQ=+10s。

1.2.5稀釋驗證試驗：取1份混合血清用0.9%氯化鈉溶液進行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16倍比稀釋，稀釋后的樣本各測定5次，計算測定均值乘以稀釋倍數的結果與原倍血清測定結果的Diff%。

1.2.6回收率驗證：在1份已測得GA濃度的混合血清樣本中分別加入低、中、高GA標準液，得到標準品混合血清工作液；另取混合血清樣本和校準品加0.9%氯化鈉溶液至標準品混合血清工作液同樣體積，測試回收率。回收率=［（標準品混合血清工作液實測濃度-混合血清實測濃度）/校準品實測濃度］×100%。

1.2.7干擾實驗：根據CLSI EP7-A2文件［11］提供的方案，將膽紅素、甘油三酯（TG）、血紅蛋白、膽汁酸、尿酸、葡萄糖、維生素C、EDTA?K2、肝素鈉、枸櫞酸鈉干擾物按要求進行配制，制成含特定量干擾物的血清，含有的膽紅素終濃度為35 mg/dL，TG為750 mg/dL、血紅蛋白為200 mg/dL、膽汁酸為8 mg/dL、尿酸為33 mg/dL、葡萄糖為1 800 mg/ dL、維生素C 15 mg/dL、EDTA?K22.5 mg/mL、肝素鈉80 U/L、枸櫞酸鈉8.0 mg/mL，同時以樣品中加入相同體積的0.9%氯化鈉溶液作基礎樣品，用本法試劑測定每個混合血清各3次，求均值，計算添加各干擾物后血清GA測定值與干擾物濃度為0時的Diff%，以±5%為標準判斷是否存在干擾。

1.2.8方法比對試驗：參考CLSI EP9-A2文件［12］提供的方案，用本法試劑和日本ASAHI公司提供的GA測定試劑分別測定100例血清標本，以本法測得的結果為X，ASAHI公司測定的結果為Y，進行線性回歸，求得線性方程和相關系數r。

1.2.9試劑穩定性驗證：將新配的GA測定試劑分成A、B 2組，A組在全自動生化分析儀4 ℃試劑倉中開蓋儲存30 d，B組在4 ℃冰箱加蓋儲存12個月，測定2組試劑空白管及濃度為800 μmol/L的GA標準管吸光度值、含量為（855±90.5）μmol/L的GA質控品測定值，每個樣本重復測定3次，求均值，用于判斷試劑穩定性。

1.3統計學處理方法 采用Excel 2003和SPSS13.0軟件對數據進行統計分析。相關分析采用線性相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1精密度評價 按本法測定3份不同GA含量的混合血清標本，批內CV（每個樣品用本法平行測定20次）在0.84%～1.88%之間，批間CV（每個樣品用本法連續測定12 d）在1.14%～2.35%之間，精密度良好，可滿足臨床應用，見表1。

表1　血清GA檢測精密度

2.2線性范圍、LOD和LOQ評價結果 取濃度1 200μmol/L的標準溶液1份，按本研究所述方法進行校準曲線繪制，所得線性回歸方程為Y（理論值）= 1.014X（測量值）-5.54，r=0.9999，表明線性可達1 200 μmol/L。按本研究所述LOD和LOQ評價方法，測定試劑的LOD為1.3 μmol/L，LOQ為3.8 μmol/L。2.3 稀釋驗證試驗 取一份濃度為1 025 μmol/L的混合血清，用本研究所述方法進行稀釋驗證，用去離子水在2～16倍稀釋范圍與原倍血清的百分偏差在99.3%～108.6%之間，滿足臨床需要。

2.4回收率驗證 取1份濃度為275 μmol/L的混合血清，加入不同量的GA標準液進行回收試驗，見表2。GA檢測平均回收率為101.8%。

表2　血清GA檢測回收率

2.5干擾實驗 用本法試劑測定含不同濃度干擾物的混合血清，以±5%為標準判斷是否存在干擾，對于GA濃度為550 μmol/L的血清檢測，各干擾物質的最大允許濃度為：膽紅素35 mg/dL，TG 750 mg/dL、血紅蛋白200 mg/dL、膽汁酸8 mg/dL、尿酸33 mg/dL、葡萄糖1 800 mg/dL、維生素C 15 mg/dL、EDTA?K22.5 mg/dL、肝素鈉80 U/L、枸櫞酸鈉8.0 mg/dL。

2.6方法比對實驗 取100例血清標本，用本法試劑和日本ASAHI公司提供的GA測定試劑分別測定，本法（X）測得的GA平均值為104.2 μmol/L（6.93 g/L），日本ASAHI公司試劑（Y）測定的GA平均值105.3 μmol/L（7.00 g/L），回歸方程為Y=0.9991X+ 0.0809，r=0.9958，經t檢驗，兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.7試劑穩定性驗證 按本研究所述方法進行試劑穩定性驗證，見表3。2組試劑到達儲存時間后，空白管及標準管吸光度值基本恒定，質控品測定值相對偏差＜10%，說明本法GA測定試劑具有良好的穩定性。

表3　GA測定試劑穩定性試驗

2.8 參考值 用本研究所述方法測定180名體檢合格成年人（男90名，女90名，年齡18～60歲）血清GA濃度，測得結果血清GA（±s）為（85.5±14.6）μmol/L，參考范圍（±2s）：56.3～114.7 μmol/L。

3　討論

糖尿病是現代疾病中的第二殺手，其對人體的危害僅次于癌癥。臨床診斷糖尿病的常用指標有血清（漿）葡萄糖和糖化血紅蛋白A1c（HbA1c）。血清（漿）葡萄糖受飲食影響較大，很難準確反映糖尿病的控制程度，HbA1c雖受飲食影響較小，但日變化幅度小，反映過去2～3個月的總血糖水平，不能及時反映糖尿病的控制程度。GA半衰期較短，測定GA的濃度可有效反映患者過去2～3周內平均血糖的水平，并不受臨時血糖濃度波動的影響。因此，GA可更靈敏、更確切地反映較短期內糖尿病的控制程度［1-4］。

在建立酶法測定GA方法學及試劑前，臨床通常采用NBT法測定GSP（果糖胺）代替GA反應過去2～3周內平均血糖的水平，存在易受血清還原性物質干擾、特異性差的缺點。本研究在有關文獻［5-7］的基礎上，通過特異性PR和球蛋白抑制劑的使用，研發了液體型GA酶法檢測試劑，該試劑精密度良好，線性范圍寬，稀釋準確性滿足臨床需要，回收率較高，抗膽紅素、TG等內源性干擾物和維生素C、EDTA?K2等外源性干擾物干擾能力較強，與日本ASAHI公司提供的GA測定試劑方法進行比對，兩者檢測結果無顯著性差異，但試劑成本僅為進口試劑銷售價格的1/8左右，具有實際推廣應用價值。

本研究在全自動生化分析儀上的對所研發的GA測定試劑分析性能進行了驗證，測試結果表明，方法的批內CV和批間CV分別在0.84%～1.88%和1.14%～2.35%之間，GA濃度在5～1 200 μmol/L之間線性良好，用去離子水在2～16倍稀釋范圍與原倍血清的百分偏差在99.3%～108.6%之間，方法平均回收率為101.8%，試劑抗膽紅素等物質干擾的能力較強，與ASAHI公司提供的GA測定試劑進行對比相關性好，測定試劑置4 ℃加蓋保存至少穩定12個月，各項方法學指標均能滿足臨床需求。限于實驗條件，本研究僅在全自動生化分析儀上進行了各項方法學指標測試，在不同實驗室、不同分析儀上的性能與本研究結果是否相同，尚有待進一步工作確認。

［1］WARWAS M， ?URAWSKA-P?AKSEJ E， CI??KA D， et al. Glycated albumin as a marker of glycemia in diabetes and its vascular complications［J］. Postepy Hig Med Dosw （Online）， 2015， 69： 638-648.

［2］LEE J W， KIM H J， KWON Y S， et al. Serum glycated albumin as a new glycemic marker in pediatric diabetes［J］. Ann Pediatr Endocrinol Metab， 2013， 18（4）： 208-213.

［3］金先富, 沈波, 王靜, 等. 評價糖化白蛋白在糖尿病患者短期血糖監測中的價值[J]. 中國臨床藥理學雜志, 2011, 27 (4): 302-305.

［4］劉延蘇, 郭紅梅, 黃婉. 3 628例非糖尿病人群糖化白蛋白的檢測與分析[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2011, 21(3): 555-558.

［5］PARONI R， CERIOTTI F， GALANELLO R， et al. Performance characteristics and clinical utility of an enzymatic method for the measurement of glycated albumin in plasma ［J］. Clin Biochem， 2007， 40（18）： 1398-1405.

［6］KOUZUMA T， USAMI T， YAMAKOSHI M， et al. An enzymatic method for the measurement of glycated albumin in biological samples［J］. Clin Chim Acta， 2002， 324（1-2）： 61-71.

［7］KOUZUMA T， UEMASTU Y， USAMI T， el al. Study of glycated amino acid elimination reaction for an improved enzymatic glycated albumin measurement method［J］. Clin Chim Acta， 2004， 346（2）： 135-143.

［8］SHIMA K， ITO N， ABE F， et al. High-performance liquid chromatographic assay of serum glycated albumin［J］. Diabetologia， 1988， 31（8）： 627-631.

［9］CLSI. User demonstration of performance for precision and trueness， Approved Guideline-Second Editon［S］. CLSI document EP15-A2. Wayne， PA： CLSI， 2008.

［10］CLSI. Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures［S］. CLSI document EP6-A. Wayne， PA：CLSI， 2003.

［11］CLSI. Interference testing in clinical chemistry， Approved-Guideline［S］. CLSI document EP7-A2. Wayne， PA： CLSI，2005.

［12］CLSI. Method comparison and bias estimation using patient samples［S］. CLSI document EP9-A2. Wayne， PA： CLSI，2002.

（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

The development and evaluation of glycated albumin enzymatic determination reagent

LIAN GuojunPAN Liqin2, LI Baoqing3, CHEN Qingsong4.1, 1.School of Environmental Science and Public Health, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Laboratory Tests, the Wenzhou People’s Hospitol, Wenzhou, 325000; 3.Department of Laboratory Tests, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 4.Zhejiang Kuake Bioscience Co.Ltd, Shaoxing, 312500

Objective: To develop and evaluate the serum glycated albumin enzymatic determination reagent. Methods: The analysis was based on the fact that the glycated albumin glycated albumin was hydrolyzed to glycated amino acids by special proteinase digestion， and glycated amino acids were oxidized to produce hydrogen peroxide， which was quantitatively measured through the Trinder's chromogenic reaction， compared with the same treatment of the standard solution. Results: The within-run and between-run CVs of this reagent were 0.84%～1.88% and 1.14%～2.35%， respectively； the method was liner in the range of 1.3～1 200 μmol·L-1， percent deviation of the measured results of diluted serum samples diluted by 2 to 16 times compared to the results of the original samples ranged from 99.3%～108.6%， the average rate of recovery was 101.8%； No signifi cant interference （bias%≤±5%） was found in the test of 550 μmol·L-1GA analysis when bilirubin ＜35 mg·dL-1， triglyceride＜750 mg·dL-1， hemoglobin ＜200 mg·dL-1， bile acid ＜8 mg·dL-1， uric acid ＜33 mg·dL-1，glucose ＜1800 mg·dL-1， Vitamin C ＜15 mg·dL-1， EDTA·K2＜2.5 mg·mL-1， Heparin Sodium ＜80 U·L-1， Sodium citrate ＜8.0 mg·mL-1. Comparing this methods （Y） with the ASAHI method （X）， the regression equations is Y=0.9991X+0.0809， r=0.9958. The reagent was stable at least 30 days when it was open cover stored and at least 12 months when it was sealed stored at 4 ℃. Conclusion: This reagent shows high precision， wide linear range，and the dilution accuracy can meet the clinical needs. It also shows high recovery， good anti-interference capability， good correlation with imported reagent， and suitable for clinical application.

glycated albumin； enzymatic determination； reagent

R446

B DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.011

2015-05-12

浙江省科技廳公益技術研究社會發展項目（2013C33240）。

連國軍（1976-），男，浙江上虞人，副教授。