重組β-甘露聚糖酶制備低聚葡甘露糖工藝條件的優化

趙 梅， 王春娟， 董運海， 李劍芳*， 鄔敏辰

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫214122）

重組β-甘露聚糖酶制備低聚葡甘露糖工藝條件的優化

趙 梅1， 王春娟1， 董運海1， 李劍芳*1， 鄔敏辰2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫214122）

研究了利用自主構建的重組畢赤酵母菌株GS115/Auman26A所產β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制備低聚葡甘露糖的工藝條件。以底物魔芋粉的水解率為指標，通過單因素試驗確定酶法制備低聚葡甘露糖的酶解條件如下：加酶量60 U/g，酶解溫度40℃，魔芋粉質量濃度30 g/L，酶解時間5 h。魔芋粉水解率和酶解液還原糖質量濃度分別為53.3%和10.45 mg/mL。超濾后的酶解產物經高效液相色譜檢測可知組分主要以低聚葡甘露糖為主，其中還原性單糖占9.83%，二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。

重組β-甘露聚糖酶；魔芋粉；低聚葡甘露糖；超濾

魔芋是廣泛分布在我國云南、四川、貴州等地區的特有經濟作物，目前在國內主要作為一種粗纖維食物或食品添加劑使用。魔芋的主要活性成分為葡甘露聚糖，它是對魔芋進行深加工利用的重要成分。魔芋葡甘露聚糖 （konjac glucomannan，KGM）是由葡萄糖和甘露糖按一定的摩爾比 （1∶1.6）以β-1，4糖苷鍵結合而成的雜多糖，在主鏈甘露糖的C3位置上存在以β-1，3糖苷鍵形成的分支結構［1］。利用酶法水解魔芋粗提產品魔芋粉制備低聚葡甘露糖 （glucomannan-oligosaccharides，GMOS），既可拓寬魔芋的應用范圍、提高原料的附加值，同時又可減少酸堿使用量，具有較好的經濟與社會效益。

β-甘露聚糖酶 （EC 3.2.1.78），是一類能夠水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的內切酶，廣泛存在于動植物及微生物中［1］。目前，低聚甘露糖可由芽孢桿菌、黑曲霉、毛霉等微生物來源的β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖 （從魔芋、角豆膠及瓜爾豆膠等植物中提取）制得［1-3］，其結構是由2～10個單糖分子通過β-1，4或β-1，3糖苷鍵連接而成。研究表明，低聚甘露糖可有效促進雙歧桿菌、乳酸桿菌等腸道有益菌群的特異性增殖，降低腸道pH以抑制有害菌的生長；可通過提高腸粘膜局部免疫力、增強動物非特異性免疫、促進肝臟分泌甘露糖結合蛋白來增強機體免疫力［4］；還具有改善血清脂質、降低膽固醇和三酸甘油酯含量、不增加血糖濃度等特點［5］，是新一代功能性食品。

采用自主構建的酵母工程菌GS115/Auman26A作為產重組β-甘露聚糖酶菌株，通過該重組酶降解魔芋葡甘露聚糖制備GMOS。與其他方法相比［6］，該方法具有產酶活性高、操作簡易、易分離純化及安全環保等優點。作者以水解率為指標，分別考察加酶量、酶解溫度、底物質量濃度以及酶解時間對酶解過程的影響。通過控制水解率 （50%～60%）并結合膜分離法制備獲得GMOS，并利用高效液相色譜（HPLC）對酶解產物進行分析，以期為后期進行單一組分的分析和進一步精制研究奠定基礎，同時也是為其工業化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

魔芋粉，購自武漢靖江魔芋制品有限公司；畢赤酵母工程菌GS115/Auman26A，由作者所在實驗室構建并保藏；D-甘露糖、角豆膠：購自Sigma公司；3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為國產分析純。YPD、BMGY 和BMMY培養基的配制參照 Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊。

1.2 β-甘露聚糖酶的制備

在 YPD平板上活化重組畢赤酵母 GS115/ Auman26A菌種，挑取重組子接種至BMGY液體培養基中，于30℃、220 r/min培養至A600 nm值為2～4；4 000 r/min離心5 min收集菌體，將菌體重懸于BMMY液體培養基中，于30℃、220 r/min誘導培養96 h，每隔24 h添加一次甲醇至終體積分數為0.5%。誘導結束后8 000 r/min離心5 min收集上清液，同時測定β-甘露聚糖酶活性。

1.3 β-甘露聚糖酶的酶活性測定（DNS法）

采用改良的DNS法測定β-甘露聚糖酶活性。取2.4 mL 5 mg/mL角豆膠溶液 （pH 5.5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）于40℃預熱5 min后加入0.1 mL適當稀釋的酶液，40℃下準確反應10 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴中顯色7 min，加入5 mL去離子水混勻后測定 A540 nm。在上述反應條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖（以甘露糖計）所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

1.4 魔芋粉總糖含量測定

總糖是指樣品被酸完全水解后所有還原性單糖之和。測定方法：準確稱取0.2 g魔芋粉，置于25 mL具塞試管內，依次加入去離子水10 mL和0.5 mL濃H2SO4，于100℃水解2 h，冷卻后用NaOH溶液中和。將中和液轉移并定容至100 mL，濾紙過濾，取上清液1 mL用DNS法測定還原糖 （以甘露糖計）量，計算總糖量。

1.5 魔芋粉水解率測定

在魔芋粉中加入β-甘露聚糖酶液 （加酶量以U/g魔芋粉計），在一定條件下進行酶解反應，取樣，離心取上清適當稀釋用DNS法測定酶解液中的還原糖 （以甘露糖計）量。

1.6 魔芋粉酶解條件試驗

利用自主構建的畢赤酵母工程菌 GS115/ Auman26A作為產β-甘露聚糖酶菌種，以魔芋粉為底物酶解制備GMOS。考慮到緩沖液會向體系帶入過多離子，故采用以去離子水代替緩沖液溶脹魔芋粉的方法［8］，以達到簡化后續產品精制工藝、減少酸堿使用量、降低生產成本及保護環境等目的。利用單因素試驗分別探討加酶量、酶解溫度、底物質量濃度以及酶解時間對酶解過程的影響，利用DNS法測定還原糖的含量，通過對水解率 （50%～60%）的控制，確定酶解魔芋粉的最優條件。

1.7 酶解產物的制備與超濾分離

以優化過的反應條件進行酶解反應，將反應完畢后的魔芋粉酶解液沸水滅酶、冷卻、離心，經0.45 μm微孔濾膜過濾后移至超濾裝置。選取截留相對分子質量為2 000的超濾膜，在0.2 MPa的壓力下進行超濾，收集超濾透過液。將收集的透過液用旋轉蒸發儀濃縮后凍干，即得GMOS干粉。準確稱取其質量，計算GMOS得率。

1.8 酶解產物定性檢測

稱取凍干后的GMOS粉末水溶至終質量濃度為2 mg/mL，用HPLC檢測酶解產物中組分的構成及含量。色譜條件：色譜柱Sugar-PakTM I（6.5 mm ×300 mm），柱溫85℃，流速0.4 mL/min，進樣量為10 μL，流動相：純水，檢測器：示差折光。根據GMOS保留時間定性，色譜峰面積歸一化法定量。

2 結果與討論

2.1 β-甘露聚糖酶活性及魔芋粉總糖量

利用DNS法測定同一批次畢赤酵母GS115/ Auman26A β-甘露聚糖酶的酶活性，其對角豆膠的酶活性為517.2 U/mL。由此可知，重組菌株GS115/ Auman26A具有極高的產酶活性，對工業化生產有著重要意義。0.2 g魔芋粉經濃H2SO4徹底水解后，定容至100 mL，測定還原糖量，計算得魔芋粉中總糖質量分數為87.1%。

2.2 魔芋粉酶解加酶量的確定

在魔芋粉質量濃度20 g/L、45℃水解4 h條件下，考察加酶量對魔芋粉水解率的影響，結果如圖1所示。當底物魔芋粉量充足、其他條件固定，反應體系不含有抑制酶活性的物質時，酶促反應的速率與酶濃度成正比。由圖1可知，當加酶量在30～60 U/g范圍時，水解率和還原糖濃度隨著加酶量的增加而逐漸增加。當加酶量為60 U/（g魔芋粉）時，水解率最高達到40.60%，還原糖質量濃度為7.07 mg/mL，之后趨于平穩。若加酶量不足，底物水解不充分；而過多的加酶量致使酶解速度過快，可將底物迅速降解為短鏈低聚糖，從而促進了單糖生成的可能性。考慮到生產成本及制備高含量的GMOS并盡量減少單糖含量的目的，所以需控制酶解過程的加酶量和酶解程度。因此，確定加酶量為60 U/g。

圖1 加酶量對魔芋粉水解率和還原糖質量濃度的影響Fig.1 Effect of the enzyme dosage on hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration

2.3 魔芋粉酶解溫度的確定

向質量濃度20 g/L的魔芋粉中添加60 U/（g魔芋粉）的β-甘露聚糖酶，置于不同溫度下水解4 h，考察酶解溫度對魔芋粉水解率的影響，結果如圖2所示。由圖可見，該酶在35～45℃時魔芋粉的水解率和還原糖質量濃度基本穩定，在40℃時魔芋粉水解率和還原糖質量濃度達到最高，分別為41.4% 和7.20 mg/mL；當溫度為50℃時，酶解能力迅速降低。通常酶的作用速率隨溫度的升高而升高，但溫度過高會降低酶的穩定性，使其部分失活直至完全失活。據之前報道顯示，該酶的最適溫度為40℃且具有良好的穩定性，之后酶活性隨溫度的升高而逐漸降低，45℃時相對酶活性為88.2%，而50℃的相對酶活性迅速下降為37.7%。由此可知，在40℃下具有最高反應速率，并可長時間發揮作用且保持較高活性，故確定酶解反應溫度為40℃。

2.4 魔芋粉酶解底物質量濃度的確定

取20 mL不同質量濃度的魔芋粉溶液，分別加入60 U/g的β-甘露聚糖酶，于40℃反應4 h，考察底物質量濃度對魔芋粉水解率的影響，結果如圖3所示。由圖可見，當魔芋粉質量濃度在5～30 g/L之間時，還原糖質量濃度呈現急速上升趨勢，隨后增加逐漸減慢；隨著魔芋粉質量濃度增加，水解率呈現先上升后下降的趨勢，當底物質量濃度達到30 g/L時，水解率最高可達42.70%；隨后逐漸降低，其原因可能是由于魔芋粉質量濃度的不斷增加導致其粘度的增加，阻礙了酶與魔芋粉的接觸，從而降低其酶解作用。但由于酶解反應可以在短時間內迅速減低魔芋粉的粘度，因此在工業生產上可以批量添加魔芋粉的方式，從而獲得高質量濃度的酶解液。

圖2 酶解溫度對魔芋粉水解率和還原糖質量濃度的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration

圖3 底物質量濃度對魔芋粉水解率和還原糖濃度的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the hydrolysis rate ofkonjac powder and reducing sugar concentration

2.5 魔芋粉酶解時間的確定

向質量濃度為30 g/L魔芋粉溶液中加入60 U/g 的β-甘露聚糖酶，于40℃反應，每隔1 h取樣測定還原糖量，考察酶解時間對魔芋粉水解率的影響，結果如圖4所示。由圖可見，當加酶量一定時，隨著酶解時間的增加，酶解率和還原糖質量濃度逐漸增加。當酶解時間達到6 h時，還原糖質量濃度和水解率逐漸平穩，還原糖質量濃度為10.45 mg/mL，其中水解率達到60.1%，極大程度提高了魔芋粉的利用率。β-甘露聚糖酶總是優先作用長鏈甘露聚糖，其活性隨甘露聚糖鏈長的降低而降低。隨著時間的延長，當底物中能被有效水解的長鏈甘露聚糖完全水解，酶轉而攻擊短鏈低聚糖促使還原性單糖生成量增加，為充分提高底物的利用率并控制水解率為50～60%，故選擇酶解時間為5 h。

圖4 酶解時間對魔芋粉水解率和還原糖濃度的影響Fig.4 Effect of time on the hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration

2.6 酶解產物組分分析

膜分離過程的實質是依據濾膜孔徑的大小使得原料側組分有選擇性地透過膜，而達到物質分離、提純和濃縮的目的。按分離粒子或分子大小將膜分離法分為：反滲透、透析、電滲析、納濾、超濾、微濾6種。反滲透和納膜過濾有望用于功能性低聚糖的分離。作者采用超濾方法將十糖以內的GMOS與甘露聚糖酶、淀粉、纖維素、高聚合度葡甘露聚糖及少量菌體進行分離。

粗糖液先經10 000 r/min高速離心、0.45 μm微孔濾膜過濾后移至超濾裝置，再經超濾膜超濾以有效地控制產物相對分子質量。收集超濾透過液，濃縮、冷凍、干燥，按照公式（3）計算其產率為48.1%。

用HPLC檢測酶解產物的組分構成及含量，結果如圖5所示。甘露糖、葡萄糖標準品的保留時間分別為13.765、12.288 min（譜圖未給出），由此可知M為甘露糖，G為葡萄糖。比較圖中出峰的保留時間，可知各種糖是按照相對分子質量從大到小規律出峰，HPLC色譜圖中自左向右分別是GMOS、葡萄糖和甘露糖。其中還原性單糖含量占9.83%，二糖以上的GMOS占90.17%。酶解液經超濾膜過濾后，截留的基本是聚合度為十糖以內的GMOS。研究證明，β-甘露聚糖酶作用于魔芋膠或角豆膠的作用位點是多糖鏈非還原端的第3或第4個糖分子。雖然不同來源的β-甘露聚糖酶對底物的作用深度不同，但主要產物是甘露低聚糖，相對來說，很少產生單糖［14］。

圖5 魔芋粉酶解產物組分的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of enzymatic hydrolysate fractions from konjac powder

3 結語

我國魔芋資源豐富，但所開發的魔芋產品品種有限，目前主要作為粗纖維食物或食品添加劑使用，采用現代生物技術開發高附加值的魔芋產品具有重要意義。利用微生物產生的β-甘露聚糖酶水解魔芋制備GMOS，可極大地拓寬魔芋應用范圍、提高其附加值，且安全環保。采用自主構建的重組畢赤酵母工程菌GS115/Auman26A作為產β-甘露聚糖酶菌株，具有產酶活性高、易分離純化等優點。以底物魔芋粉的水解率為指標，通過單因素試驗確定酶法制備低聚葡甘露糖的酶解條件如下：加酶量60 U/g，酶解溫度40℃，魔芋粉質量濃度30 g/L，酶解時間5 h。在優化條件下進行酶解反應，測得魔芋粉水解率和酶解液還原糖質量濃度分別為53.3%和10.45 mg/mL。超濾后的酶解產物經高效液相色譜檢測可知，組分主要以十糖以內的GMOS為主，其中還原性單糖含量占9.83%，二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。作者所建立的生產工藝操作簡單，成本較低，生產流程不對環境造成污染，具有良好的經濟效益和社會效益。

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Optimization of Hydrolytic Conditions for Glucomannan-Oligosaccharides by Recombinant β-Mannanase

ZHAO Mei1， WANG Chunjuan1， DONG Yunhai1， LI Jianfang*1， WU Minchen2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The hydrolytic conditions of konjac powder were optimized for glucomannanoligosaccharides （GMOS） by recombinantβ-mannanase produced from Pichia pastoris GS115/Auman26A.The condition was optimized using the single factor test with the hydrolysis rate of substrate as the index.The optimized enzymatic condition was determined to use 60 U enzyme per gram konjac powder and 30 g/L konjac powder at 40℃for 5 h enzymolysis.The hydrolysis rate of konjac powder and reducing sugar concentration were 53.3%and 10.45 mg/mL，respectively.The enzymatic hydrolysate after ultrafiltration was detected by high performance liquid chromatography （HPLC）.The hydrolysate was mainly composed by glucomannan-oligosaccharides，including 9.83% reducing monosaccharide and 90.17%glucomannan-oligosaccharides.This research can greatly improve the added value of konjac powder and lay the research foundation for further refining and functionalization of GMOS.

β-mannanase，glucomannan-oligosaccharides，konjac powder，ultrafiltration

Q 78

A

1673—1689（2016）07—0704—05

2015-01-08

國家自然科學基金項目（31271811）。

李劍芳（1965—），女，江蘇無錫人，工學博士，教授，主要從事食品與生物技術研究。E-mail：lijf@163.com