雙歧桿菌膽鹽水解酶基因的重組表達、純化與酶學性質

周曉玲， 張 娟， 陳 堅， 堵國成

（1.食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室 江南大學，江蘇 無錫214122；4.江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；5.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

雙歧桿菌膽鹽水解酶基因的重組表達、純化與酶學性質

周曉玲1，2，5， 張 娟2，5， 陳 堅3，5， 堵國成*4，5

（1.食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室 江南大學，江蘇 無錫214122；4.江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；5.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

為了提高膽鹽水解酶在大腸桿菌中的表達量，研究重組膽鹽水解酶的酶學性質。利用大腸桿菌表達系統，對雙歧桿菌來源的膽鹽水解酶進行了表達。將PCR獲得的膽鹽水解酶基因克隆至表達載體pET-22b（+），得到重組質粒pET-22b（+）-bsh，并轉化大腸桿菌BL21（DE3）。經發酵優化，重組菌在20℃、IPTG 1 mmol/L條件下誘導32 h可達最高酶活，對甘氨脫氧膽酸鈉和牛磺酸脫氧膽酸鈉的酶活分別為135.2 U/mL和121.3 U/mL。采用鎳親和層析柱對重組膽鹽水解酶進行純化，經SDS-PAGE分析，膽鹽水解酶相對分子質量（Mr）為35.0×103。酶學性質研究表明，重組膽鹽水解酶偏好水解甘氨結合膽鹽，對甘氨膽酸鈉的催化活性最高，達到220.1 U/ mg。酶催化反應的動力學參數經Hill方程擬合，希爾系數大于1，表明底物與酶之間存在協同作用，且不同底物與重組膽鹽水解酶之間存在不同的協同作用，表明重組膽鹽水解酶屬于變構酶。研究結果為其他來源膽鹽水解酶在基因工程菌中的表達，和進一步研究膽鹽水解酶的結構和催化反應機理提供了參考。

膽鹽水解酶；雙歧桿菌；大腸桿菌；重組表達；酶學性質

人體血清中膽固醇含量過高會引發動脈粥樣硬化和心腦血管疾病。已有研究證實，益生菌及其制品有降低血清中膽固醇的功效，而其降膽固醇作用可能與菌體產生的膽鹽水解酶相關。膽鹽水解酶（Bile Salt Hydrolase，BSH）能夠水解、結合膽鹽形成氨基酸和游離膽汁酸，游離膽汁酸會與膽固醇形成復合物共沉淀，從而降低血清中膽固醇含量［1］。已有報道中，BSH活性［2］已經從很多來自哺乳動物胃腸道的菌體中檢測出來，包括雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌。其中，雙歧桿菌是人類胃腸道最主要的微生物群落之一［3］。與其他來源的BSH比較發現，雙歧桿菌來源的BSH具有更廣泛的分布和更高的活性，在大腸桿菌中表達胞內提取液可以檢測出酶活［2］，而乳酸菌來源的BSH在大腸桿菌中表達則極易形成包涵體［4］。

目前，國內外關于BSH的研究報道中，Kim等人［3］的研究發現，BSH基因在所有被測試的雙歧桿菌中高度保守，并且這些雙歧桿菌都檢測出具有BSH活性。在關于BSH異源表達的報道中，黃茜［4］等在利用MBP融合標簽對植物乳桿菌來源的BSH進行融合表達后，BSH在細胞內的可溶性顯著提高。而董自星［5-6］利用雙精氨酸信號肽將植物乳桿菌BBE7來源的BSH在大腸桿菌中進行分泌表達，利用信號肽α-factor將BSH在畢赤酵母中分泌表達。Hiroshi等人［7］第一次從雙歧桿菌屬中克隆并分析了BSH基因，報道了長雙歧桿菌來源的BSH是一個四聚體以及它的酶學性質。R.Suresh Kumar等人［8］從長雙歧桿菌中克隆了BSH基因，在大腸桿菌中過量表達，研究發現BSH的晶體屬于六角晶系。Kim等人［3］將B.bifidum ATCC 11863來源的BSH基因在大腸桿菌中表達，發現重組BSH和野生菌來源的BSH在底物偏好性上相似，對甘氨膽酸的相對酶活最高，但是對牛磺膽酸的相對酶活只有40%。Hiroshi等人［7］研究了B.longum SBT2928來源的BSH的性質，發現其對甘氨鵝脫氧膽酸相對酶活最高。已有關于雙歧桿菌來源的BSH異源表達的報道中，主要研究了酶的結構和膽鹽耐受性，而關于酶的活性和異源表達水平的研究較少。

本研究中利用大腸桿菌表達雙歧桿菌來源的BSH，獲得了可以高效表達BSH的重組菌，并對表達條件進行了優化，確立了表達條件并提高了重組BSH的表達量。此后，進一步對BSH進行純化并研究其酶學性質，重組BSH可以水解人體6種主要膽鹽，其中對甘氨膽酸的水解活性最高，對牛磺膽酸的相對酶活也可達到70.3%。動力學參數表明，重組BSH屬于變構酶，且不同的底物和重組酶之間的協同作用有較大的差別。研究結果可以作為進一步研究BSH的結構和作用機制的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌JM109和BL21 （DE3），以及質粒pET-22b（+），均為作者所在實驗室保存。 由GenBank提供的雙歧桿菌（Bifidobacteriuminfantis KL412）膽鹽水解酶的基因序列（GenBank登錄號：AY530821.1），根據大腸桿菌BL21（DE3）的密碼子偏好性進行優化，在生工生物工程（上海）股份有限公司合成得到BSH基因。

1.1.2 試劑、引物合成和DNA測序 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；甘氨膽酸（GCA），甘氨脫氧膽酸鈉（GDCA），甘氨鵝脫氧膽酸（GCDCA），牛磺膽酸（TCA），牛磺酸脫氧膽酸鈉（TDCA），牛磺鵝脫氧膽酸（TCDCA），均購自Sigma公司。BSH基因合成、引物合成和DNA測序，由生工生物（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 培養基 大腸桿菌種子培養使用LB培養基：酵母浸出粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；發酵使用TB培養基：酵母浸出粉24 g/L，蛋白胨12 g/L，甘油4 g/L，KH2PO417 mmol/L，K2HPO472 mmol/L。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建 根據BSH基因序列設計引物bshF、bshR，以合成的BSH基因為模板，PCR擴增基因。PCR條件為：95℃預變性5 min；98℃10 s；57℃30 s；72℃1 min，30個循環；68℃延伸10 min。將PCR產物進行膠回收，用快切酶Nde I、Xhol對回收的PCR產物和質粒pET-22b（+）雙酶切，使用連接酶將片段與載體連接（16℃，8 h）。

1.2.2 轉化及重組子的篩選 將連接液與大腸桿菌JM109感受態細胞混勻，冰上靜置30 min，42℃熱擊90 s，加入0.6 mL LB培養基，37℃、200 r/min培養1 h，均勻涂布于LB固體培養基，37℃倒置培養10 h。菌落PCR和雙酶切驗證選取陽性克隆，提取質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序正確的質粒pET-22b（+）-bsh轉化大腸桿菌BL21（DE3），菌落PCR，挑選陽性克隆。得到大腸桿菌BL21（DE3）（pET-22b（+）-bsh）。

1.2.3 目的基因的誘導表達 挑取大腸桿菌BL21 （DE3）（pET-22b（+）-bsh）單菌落接種到LB液體培養基，37℃、200 r/min培養過夜。種子液以體積分數2%接種量轉接到TB培養基，37℃、200 r/min培養至OD600為0.6時加入IPTG（終濃度1 mmol/L），誘導10 h。通過測定酶活和SDS-PAGE驗證重組菌的表達。分別在不同溫度下（20、25、30、37℃）培養，定時取樣檢測胞內酶活，從而得到最佳誘導溫度和時間。在20℃下培養，分別加入不同終濃度的IPTG （0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L），定時取樣檢測胞內酶活，從而得到最佳IPTG誘導濃度。

1.2.4 重組膽鹽水解酶酶活的測定方法 重組菌生產的BSH活性的測定是通過測量酶與底物反應釋放出來的氨基酸的量來確定的，具體方法參照文獻［6］。一個單位BSH酶活定義為：37℃下，BSH每分鐘催化底物生成1 μmol氨基酸。

1.2.5 重組膽鹽水解酶的純化 在確定的重組菌最佳表達條件下誘導表達，收集菌體，超聲破碎后離心取上清液。結合緩沖溶液：20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.4。洗脫緩沖溶液：20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，0.5 mol/L NaCl，0.5 mmol/L咪唑，pH 7.4。用5～15 mL的結合緩沖溶液以 1 mL/min的體積流量平衡純化柱HisTrap FF crude（1 mL）（美國GE公司制品）。樣品以1 mL/min體積流量流進純化柱，然后用15 mL結合緩沖溶液將未結合蛋白質洗脫，最后用洗脫緩沖溶液梯度洗脫，收集目的蛋白質。

1.2.6 重組膽鹽水解酶酶學性質的測定

1）BSH最適反應pH與pH穩定性測定：分別在 pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和 8.5條件下測定，重組BSH的酶活（以GDCA為底物）以最高值作為100%；酶液分別在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0下孵育30 min，測定BSH酶活，以未孵育的樣品的酶活為100%。不同pH環境所用的緩沖液為：50 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.0～5.5），50 mmol/L磷酸鈉緩沖液 （pH 6.0～9.0）。

2）BSH底物特異性測定：分別以GCA、GDCA、GCDCA、TCA、TDCA和TCDCA為底物，測定重組BSH酶活，以酶活最高值為100%。

3）不同金屬離子對重組BSH的影響：酶活測定反應體系中加入終濃度為5 mmol/L的不同金屬離子，測定殘余酶活，以未加入金屬離子的酶活性為100%，從而得到不同金屬離子對重組BSH酶活的影響。

1.2.7 重組膽鹽水解酶反應動力學參數的測定不同濃度的底物GDCA、TDCA加入反應體系中，37℃下孵育30 min，測定比酶活。利用Origin軟件，根據Hill方程擬合數據并計算重組酶催化反應活性（Vmax），酶反應速率最大時底物濃度（S0.5），轉換數（kcat）。Hill方程為

式中，v是反應速度，［S］為底物濃度，h是希爾系數，S0.5是最大反應速度一半時的底物濃度。

2 結果與討論

2.1 基因克隆和載體構建

以合成的膽鹽水解酶基因為模板 （見圖1），用引物bshF、bshR（見表1）進行PCR，得到PCR產物，電泳結果顯示片段大小與已知945 bp相符，如圖2所示。

按照1.2.1所述方法構建質粒，獲得pET-22b （+）-bsh，見圖3。

圖1 膽鹽水解酶的原始基因和優化的基因Fig.1 Original and optimal gene sequence of bile salt hydrolase

表1 引物列表Table1 List of primers

圖2 PCR擴增結果電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR products

將上述得到的重組質粒pET-22b（+）-bsh轉化大腸桿菌BL21（DE3），經菌落PCR驗證獲得大腸桿菌BL21（DE3）（pET-22b（+）-bsh），見圖4。

2.2 重組膽鹽水解酶表達條件優化

為了研究誘導溫度對BSH酶活的影響，將誘導的重組大腸桿菌BL21（DE3）（pET-22b（+）-bsh）在各個溫度下培養，BSH對兩種底物GDCA、TDCA酶活隨著誘導溫度與誘導時間的變化如圖5所示。重組菌在20℃下誘導32 h，其酶活最高，對GDCA酶活為135.2 U/mL，對TDCA酶活為121.3 U/mL。而在37℃下誘導，BSH對 GDCA、TDCA的酶活僅為23.1 U/mL、12.5 U/mL。而重組BSH對甘氨結合膽鹽的活性高于牛磺結合膽鹽的活性，這可能是由于重組BSH優先識別底物的氨基酸基團［9］。從圖5可見，BSH對GDCA、TDCA兩種底物的最高酶活都隨著誘導溫度的降低而升高。可能的原因是，溫度過高，菌體生長與代謝速率加快，酶的合成速率也很快，導致一些蛋白質來不及折疊，蛋白質累積形成包涵體［10］。黃茜等［4］、戰媛媛等［11］的研究均發現，大腸桿菌系統表達乳桿菌來源的BSH時均會形成包涵體。與乳酸菌來源的BSH比較，雙歧桿菌來源的BSH異源表達酶活性較高，Lactobacillus casei Zhang［12］來源的BSH酶活性為2.84 U/mL，植物乳桿菌BBE7［6］來源的BSH在酵母中分泌表達與發酵優化，最終的酶活可達到2.69 U/mL。

圖3 重組質粒pET-22b（+）-bsh的構建Fig.3 Construction of recombinant plasmid pET-22b（+）-bsh

圖4 大腸桿菌BL21（DE3）（pET-22b（+）-bsh）的PCR鑒定Fig.4 Identification of recombinant E.coli BL21（DE3）（pET-22b（+）-bsh）by PCR

圖5 誘導溫度與時間對膽鹽水解酶酶活的影響Fig.5 Effect of time and temperature on bile salt hydrolase activity

研究中分別添加了不同終濃度的IPTG，在20℃誘導培養，結果如圖6所示。0.4 mmol/L IPTG誘導表達，BSH對GDCA、TDCA酶活分別為68.1 U/mL、43.5 U/mL。在 IPTG濃度 1 mmol/L時，BSH對GDCA、TDCA兩種底物的酶活達到最高，分別為133.1 U/mL、120.3 U/mL。此時，T7啟動子能夠被完全啟動。當 IPTG濃度 1.2 mmol/L時，BSH對GDCA、TDCA兩種底物的酶活有很大程度的降低，分析原因可能是高濃度IPTG對大腸桿菌的生長有抑制作用，從而使發酵液OD600下降。

圖6 IPTG濃度對膽鹽水解酶酶活的影響Fig.6 Effect of IPTG concentration on bile salt hydrolase activity

2.3 表達產物的鑒定與純化

SDS-PAGE對比分析，陽性大腸桿菌 BL21 （DE3）（pET-22b（+）-bsh）經IPTG誘導，菌體破碎后的上清液中含有特異性條帶，相對分子質量（Mr）約為35 kDa（圖7），這與已知BSH的相對分子質量相符。有文獻報道，雙歧桿菌來源BSH的N端Cys2是其催化反應的中心［3］。前期研究發現，在BSH的N端添加組氨酸標簽，胞內未檢測出BSH活性。本課題研究中通過設計引物，在BSH的C端添加組氨酸標簽，使用Ni柱親和層析純化，純化后的BSH對GDCA酶活可以達到184.7 U/mg，對TDCA酶活可以達到86.8 U/mg。重組表達的BSH的活性遠低于野 生 菌 雙 歧 桿 菌 Bifidobacterium infantis KL 412BSH的活性［13］。解釋原因：1）大腸桿菌表達重組BSH時，由于大腸桿菌菌體生長與代謝速率很快，酶的合成速率也很快，導致重組表達的BSH來不及正確折疊［10］，從而使酶的活性下降；2）BSH的N端Cys2為催化中心，而重組表達蛋白質為胞內酶，經超聲破碎，BSH釋放到胞外，在胞外氧化環境下，催化中心Cys2含有巰基，容易被氧化。3）不同的大腸桿菌表達宿主對重組BSH的表達和活性影響很大［14］。

2.4 重組膽鹽水解酶的酶學性質

由圖8可以看出，BSH對甘氨結合膽鹽酶活明顯高于牛黃結合膽鹽，其中BSH對GCA酶活最高，為220.1 U/mg。重組BSH對TCA的相對酶活為70.3%，對TCDCA酶活最低，僅為最高酶活的35.4%，這一結果與文獻報道基本一致［7，12，17］。其中，重組BSH對TCA的相對酶活70.3%高于文獻報道的其他來源的BSH［14］。與文獻報道的其他來源的膽鹽水解酶相比［5，7，12］，本課題研究中的重組BSH對甘氨結合膽鹽和牛黃結合膽鹽的水解活性較強。

圖7 重組膽鹽水解酶的表達與純化的SDS-PAGE分析Fig.7 SPS-PAGE analysis ofrecombinantbilesalt hydrolase

圖8 膽鹽水解酶底物特異性Fig.8 Substrate specificity of recombinant bile salt hydrolase

已有文獻報道，金屬離子對BSH的活性有不同的激活和抑制作用［7，13，17-18］，本研究中不同的金屬離子對BSH有激活和抑制作用。由表2可以看出，Mg2+、Li2+和Ca2+對BSH的活性促進作用明顯，Cu2+、Zn2+和Mn2+對BSH的活性有明顯的抑制作用，這可能是因為金屬離子氧化BSH活性位點Cys2的巰基［12］，B.longum SBT2928［9］來源的BSH活性也被一些氧化巰基的試劑強烈抑制。

表2 不同金屬離子對膽鹽水解酶活性的影響Table2 Effect of different metal ions on activity of the purified bile salt hydrolase

由圖9可以看出，重組BSH的最適反應pH范圍為6.0～7.0，在pH 6.0時酶活性最高。當pH低于6.0或者高于7.0時，重組BSH的酶活明顯下降。當pH低于4.0或者高于8.5時，重組BSH幾乎完全失活。這與植物乳桿菌BBE7來源的BSH的最適反應pH 范圍 （5.6～6.4） 差別較大［5］， 而與來自Lactobacillus fermentum NCDO394的 BSH的最適pH范圍（6.0～7.0）一致［19］。重組BSH在pH 6.0～8.0穩定性最好，37℃放置30 min后，重組酶保留90%以上活性。這個范圍也比其他來源的［5］膽鹽水解酶pH穩定性范圍（7.0～8.0）寬。而當pH低于6.0或者高于8.5時，重組酶殘留活性快速下降至幾乎完全失活。文獻報道，BSH在極端pH環境下會發生不可逆失活［9］。

分別測定了重組BSH在不同底物GDCA、TDCA濃度下重組酶催化反應的比酶活，數據擬合符合Hill方程，希爾系數h大于1，表明底物對重組酶催化反應的正協同效應，因此推測重組BSH屬于變構酶。這一結果和Lactobacillus salivarius來源的BSH一致［20］，這可能是底物與酶的一個亞基上的活性中心結合后，通過構象的改變，增強了酶的其他亞基的活性中心與底物的結合，便出現了正協同效應，使底物濃度與酶催化反應速率的曲線呈S形［21］。本研究中，在重組酶與底物反應體系中加入DTT則會使動力學曲線的S形消失，酶反應動力學曲線通過數據擬合，符合米氏方程，呈現雙曲線形式。這一現象在Lactobacillus salivarius來源的BSH文獻中也有報道［20］。從圖10可以看出，不同濃度的GDCA 和TDCA與重組BSH在催化反應時表現出不同的協同作用。即底物濃度低時，酶活性的增加較慢，當底物濃度高到一定程度后，酶活性顯著加強，最終達到最大值。

圖9 pH對BSH活力和穩定性的影響Fig.9 Effects ofpH on activity and stability of recombinant bile salt hydrolase

圖10 膽鹽水解酶反應動力學參數測定Fig.1 0 Determination ofkineticparametersofthe purified bile salt hydrolase

從表3可以看出，重組BSH對GDCA的催化效率 （kcat） 和親和力 （kcat/S0.5）高于TDCA。 而Lactobacillus salivarius來源的BSH對牛磺結合膽鹽的催化效率高于對甘氨結合膽鹽的催化效率［20］。

3 結語

利用重組大腸桿菌BL21（DE3）（pET-22b（+）-bsh），實現了雙歧桿菌來源BSH的表達。通過對影響大腸桿菌表達的誘導溫度和IPTG濃度進行優化，得到了重組菌搖瓶發酵的最優發酵條件。降低溫度并延長發酵時間可以顯著提高重組酶的酶活，重組菌在20℃、IPTG 1 mmol/L條件下誘導32 h，其總酶活最高。純化后的重組BSH具有廣泛的底物水解范圍，對甘氨結合膽鹽水解活性高于牛黃結合膽鹽。重組BSH有較寬的最適pH和pH穩定性范圍，并表現出對金屬離子的依賴性。重組BSH催化反應的動力學參數符合變構酶的特性。

本研究結果可以為基因工程菌發酵生產BSH和進一步研究BSH的結構，揭示BSH催化反應的機理提供參考。

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Expression，Purification and Enzymatic Properties Study of the Bile Salt Hydrolase from Bifidobacterium in Escherichia coli

ZHOU Xiaoling1，2， ZHANG Juan2，5， CHEN Jian3，5， DU Guocheng*4，5
（1.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China； 3. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；5.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The bile salt hydrolase gene from Bifidobacteriuminfantis KL412 was expressed using Escherichia coli to increase the expression level and study the enzymatic properties of the recombinant bile salt hydrolase.The bile salt hydrolase gene was first amplified by PCR and clonedinto the expression vector pET-22b （+）.The recombinant plasmid pET-22b （+）-bsh was the transformed to E.coli BL21（DE3）.The optimized activity to glycodeoxycholic acid（GDCA）and taurine sodium deoxycholate（TDCA）of the recombinant bile salt hydrolase could reach to 135.2 U/mL and 121.3 U/mL at 20℃ for 32 h with 1 mM IPTG.The molecular weight of bile salt hydrolase was 35.0×103analyzed by SDS-PAGE after purification through Ni-chelating affinity chromatography.The investigation on enzymatic properties showed that the recombinant bile salt hydrolase had a preference to glycine bile salts and a highest activity was achieved at 220.1 U/mg to sodium glycocholate（GCA）.This study provided a reference for the expression of bile salt hydrolase from different sources in genetically engineered bacteria and the further study of the structure and catalytic mechanism of bile salt hydrolase.

bile salt hydrolase，Bifidobacterium，Escherichia coli，recombinant expression，enzymatic properties

Q 939.9；Q 78

A

1673—1689（2016）06—0792—09

2014-12-16

國家863計劃項目 （2011AA100905）；國家自然科學基金項目 （31100064）；教育部長江學者和創新團隊發展計劃項目（IRT1135）；中央高校基本科研業務費專項（JUDCF10045）；江蘇省自然科學基金項目（BK2012553）。

堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發酵過程優化與控制、酶工程與技術、代謝工程技術的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn