Colletotrichum lini ST-1靜息細胞轉化DHEA制備7α，15α-diOH-DHEA的工藝

尹思淇， 李 聰， 吳 燕， 李 會， 史勁松， 許正宏

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

Colletotrichum lini ST-1靜息細胞轉化DHEA制備7α，15α-diOH-DHEA的工藝

尹思淇， 李 聰， 吳 燕， 李 會*， 史勁松， 許正宏

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

利用亞麻刺盤孢（Colletotrichum lini ST-1）靜息細胞轉化去氫表雄酮，制備三羥基雄甾烯酮，通過單因素優化確定了最佳搖瓶轉化條件：細胞質量濃度為12 g/L，pH值為6.5，裝液量為30 mL/250 mL，轉速為220 r/min，溫度為30℃。在上述條件下，底物投料質量濃度為10 g/L時，轉化48 h，產物摩爾得率為38.5%，較生長細胞提高了21.0%。在上述工作基礎上，嘗試了靜息細胞連續批次轉化，最終通過兩批次的連續轉化，在底物累計投料質量濃度為18 g/L時，轉化78 h，產物的累積質量濃度高達12.1 g/L，產物摩爾得率可達60.5%。

亞麻刺盤孢；去氫表雄酮；三羥基雄甾烯酮；靜息細胞；批次轉化

靜息細胞是指一類可以進行有氧非生長代謝的細胞，通常將培養好的細胞懸浮于不含營養物質或只含碳源（如葡萄糖）的轉化液中，然后添加底物進行生物催化反應。這種轉化方式彌補了傳統發酵轉化的諸多不足［1-2］，便于對反應條件進行控制；減少了反應過程干擾因子，保證了催化反應的高效性和專一性；有利于產物的分離純化。目前，靜息細胞法已經被應用于天然化合物的特定位點催化、有機化合物的不對稱反應、藥物前體化合物的生物合成及藥物活性成分的篩選及新藥研究等多個領域［3-4］。

去氫表雄酮（DHEA）可用于合成多種甾體激素類藥物的中間體，具有抗衰老及蛋白質同化作用，其代謝產物能夠促進機體的免疫應答［5］。DHEA通過生物轉化作用，在C7位和C15位分別加入一個氧原子，生成具有重要醫用價值和市場價值的甾體激素藥物三羥基雄甾烯酮。三羥基雄甾烯酮（7α，15α-diOH-DHEA）是合成新型口服避孕藥“優思明”主要成分屈螺酮的關鍵中間體［6］。“優思明”是全球銷量第一的女用口服避孕藥，具有高效、低毒、無副作用等優點，全球需求量大，市場前景廣闊。Colletotrichum lini是現有文獻報道中可以催化底物DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA轉化能力最強的菌株，目前主要采用生長的全細胞進行轉化，轉化效率低（僅 60%左右），底物投料質量濃度低于8 g/L［7-8］。以實驗室誘變得到的一株C.lini ST-1為研究對象［9］，研究以靜息細胞法制備7α，15α-diOHDHEA的工藝過程，從而進一步提高其轉化效率。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

亞麻刺盤孢（C.linli ST-1），由作者所在實驗室通過復合誘變方法篩選得到。

1.2 培養基

1）斜面固體培養基（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖20，瓊脂20；自然pH，121℃滅菌20 min。

2）種子培養基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米漿3，豆餅粉10；自然pH，121℃滅菌20 min。

3）發酵培養基（g/L）：葡萄糖15，酵母粉 15，玉米漿3；自然pH，121℃滅菌20 min。

4）轉化培養基 （g/L）：Na2HPO4·12H2O 22.56，NaH2PO4·2H2O 21.37。

1.3 菌體的培養

從斜面挑取適量菌絲接入含有100 mL種子培養基的500 mL的錐形瓶中，于220 r/min，30℃搖床條件下培養72 h。將培養好的一級種子以體積分數10%的接種量轉接至新的種子培養基中進行二次活化，搖床條件220 r/min，30℃，培養24 h。

1.4 生長細胞轉化

以體積分數10%的接種量將二級種子液轉接至30 mL/250 mL的轉化培養基中，于220 r/min，30℃搖床培養。當培養24 h后，準確稱取10 g/L的DHEA于培養基中進行轉化，每隔6 h取樣檢測。

1.5 靜息細胞的制備與轉化

以體積分數10%的接種量將二級種子液轉接至30 mL/250 mL的轉化培養基中培養24 h（搖床條件220 r/min，30℃）。離心收集菌絲體，用事先配制的磷酸鈉緩沖液洗滌菌體2遍，離心 （8 000 r/ min，10 min）收集菌體。準確稱取3.5 g濕質量的菌體，投入含有30 mL磷酸鈉緩沖液的250 mL的搖瓶中 （細胞干質量12 g/L），同時添加10 g/L的DHEA和質量濃度2 g/dL的吐溫80進行轉化，搖床條件為220 r/min，30℃。轉化過程中每隔6 h取樣檢測。

1.6 靜息細胞批次轉化

準確稱取3.5 g濕質量的菌體投入含有30 mL磷酸鈉緩沖液（pH 6.5，0.2 mol/L）的250 mL的搖瓶中（細胞干質量12 g/L），同時添加10 g/L的DHEA 和2 g/dL的吐溫80進行轉化。搖床條件為220 r/ min，30℃，轉化過程中每隔6 h取樣檢測。當底物轉化率達到90%時，結束第一批次的轉化。轉化液離心后倒出上清液，將菌體重新置于新的磷酸鈉緩沖液中，重新添加4～10 g/L的底物和1 g/dL的吐溫80進行第二批次的轉化，轉化條件相同。第三批次的轉化條件同第二批次。

1.7 薄層層析檢測產物

用移液器吸取500 μL的轉化液，用等體積的乙酸乙酯進行萃取，充分振蕩10 min，用移液器吸取2.5 μL上清液點樣，然后在展開劑（氯仿-甲醇體積比=15∶1）中展開10～15 min，用顯色劑（濃硫酸-乙醇體積比=1∶1）進行顯色，105℃加熱2 min。

1.8 高效液相檢測產物

轉化結束后取800 μL轉化液，用800 μL乙酸乙酯反復萃取5～6遍。合并萃取過程的上清液，濃縮得到底物和產物的混合物，復溶于8倍體積的乙腈中，用0.22 μm有機濾膜過濾除雜，采用HPLC定量分析。分析條件：安捷倫C18反相柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相（乙腈-水體積比=7∶3），柱溫30℃，體積流量0.5 mL/min，進樣量10 μL，紫外檢測波長 206 nm。產物摩爾得率（7α，15α-diOH-DHEA）的計算公式如下：

式（1）中：X為液相測得的產物質量濃度，g/L；c為投加的底物質量濃度，g/L；M為底物與產物的摩爾質量，g/moL。文中產物特指7α，15α-diOH-DHEA，不包含副產物。

2 結果與討論

2.1 菌齡對靜息細胞轉化的影響

靜息細胞的轉化過程主要依賴胞內酶的活力，而菌體的不同生長階段，其生理活性和酶表達水平有非常大的差異。因此，以不同生長階段的菌體制備成靜息細胞來轉化DHEA（10 g/L），菌體質量濃度為10 g/L，在30℃，220 r/min搖床條件下轉化24 h，檢測其產物的摩爾得率，結果如表1所示。隨著菌體培養時間的增加，產物的摩爾得率增加明顯；在菌體培養到24 h時，產物摩爾得率最高為34.3%；當菌體培養時間超過24 h時，產物摩爾得率又出現了下降。因此選擇培養時間為24 h的菌體進行轉化。

表1 菌齡對產物摩爾得率的影響Table1 Effect of mycelia age on molar product yield

2.2 靜息細胞轉化的條件優化

2.2.1 細胞質量濃度對轉化的影響 考察了不同的細胞質量濃度對產物摩爾得率的影響，底物投料質量濃度為10 g/L，220 r/min，30℃搖床條件下轉化48 h（見圖1）。由圖1可以看出，當細胞質量濃度為12 g/L時，產物的摩爾得率最高，而當細胞質量濃度繼續升高時，產物摩爾得率呈下降趨勢。因此，反應過程細胞質量濃度應控制在12～14 g/L之間。

2.2.2 pH值對轉化的影響 考察了不同pH值對產物摩爾得率的影響，結果如圖2所示。實驗結果顯示，pH值對產物摩爾得率的影響較大，且酸性環境較堿性環境更有利于反應的進行，當pH值為6.5時，產物的摩爾得率最高。分析其原因，pH值對酶活性的影響較大，弱酸性的條件下，酶的活性較高。因此，選擇轉化的最適pH值為6.5。

圖1 細胞質量濃度對產物摩爾得率的影響Fig.1 Effect of cell concentration on molar product yield

圖2 pH值對產物摩爾得率的影響Fig.2 Effect of pH on molar product yield

2.2.3 溶氧對轉化的影響 DHEA羥基化過程需要氧的參與［10］，因此轉化過程的溶氧水平與7α，15αdiOH-DHEA的產量有著密切的聯系。在搖瓶轉化過程中裝液量和轉速是影響溶氧的兩個主要因素，考察了250 mL的搖瓶轉化過程中不同裝液量及轉速對產物摩爾得率的影響，如圖3和圖4所示。

圖3 裝液量對產物摩爾得率的影響Fig.3 Effect of liquid volume on molar product yield

由圖3可知，在250 mL的錐形瓶中裝液量為30 mL時，產物的摩爾得率最高；當裝液量過高或者過低時，產物摩爾得率出現了不同程度的降低。分析其原因，裝液量太大會影響氧分子傳遞，使反應過程溶氧降低，限制轉化的進行；而裝液量太小，相同的轉速下菌體振蕩幅度太大，剪切力過大容易造成菌絲體斷裂。因此，選擇最適轉化的裝液量為30 mL/250 mL。

圖4 轉速對產物摩爾得率的影響Fig.4 Effect of rotation speed on molar product yield

由圖4可知，轉速的變化對產物摩爾得率的影響很明顯，當轉速為220 r/min時，產物摩爾得率最高；轉速在160～220 r/min，隨著轉速的增加，產物摩爾得率也逐漸增加；轉速超過220 r/min時，產物摩爾得率開始下降。分析其原因，在一定范圍內轉速的增加有利于溶氧的提高，也利于氧分子的傳遞，可以促進轉化的進行；而轉速過大時，高轉速產生的強剪切力會對轉化過程的菌體造成損傷，不利于轉化進行。因此，選擇最適轉速為220 r/min。

2.2.4 溫度對轉化的影響 由圖5可以看出，溫度變化對產物摩爾得率的影響非常大，當溫度超過35℃，轉化過程受到明顯抑制，而在30℃時可以得到最高的產物摩爾得率。分析其原因，酶對反應溫度非常敏感，溫度過高，酶活受到抑制，而低溫亦不利于轉化進行。因此，選擇最適反應溫度為30℃。

圖5 溫度對產物摩爾得率的影響Fig.5 Effect of temperature on molar product yield

2.2.5 轉化過程分析 在上述轉化條件優化的基礎上，對比了靜息細胞轉化和傳統生長細胞轉化的曲線。如圖6所示，利用靜息細胞轉化DHEA的產物摩爾得率較生長細胞的產物摩爾得率要高，在轉化48 h后，產物摩爾得率提高了21.0%，表明靜息細胞可用于DHEA的轉化生產，且較生長細胞存在一定的優勢。

2.3 靜息細胞批次轉化

霉菌較長的生長和轉化周期是限制其工業應用的一個重要因素，靜息細胞轉化較生長細胞轉化的另一個優勢是細胞的可重復利用。由于轉化過程底物的溶解度非常小，所以在底物投料的同時添加2 g/dL的吐溫80作為底物助溶劑。圖7是底物投料質量濃度10 g/L時，添加2 g/dL的吐溫80助溶后的轉化曲線。由圖7可知，在轉化進行到30 h時，底物的利用率已達到90%，且產物摩爾得率也趨于平穩，此時可進行第二批次轉化。

圖6 靜息細胞和生長細胞的轉化曲線比較Fig.6 Conversion curves with resting cells and growing cells

圖7 優化后的轉化曲線Fig.7 Conversion curves after optimization

DHEA的水溶性較差，產物在增加了兩個羥基后親水性得到改善，因此轉化液離心后上清液中的主要成分為7α，15α-diOH-DHEA，若此時取出菌體重新置于新的轉化體系中進行轉化，既可以提高菌體的利用率，同時也有利于解除產物的反饋抑制。考慮到底物對菌體的毒性，在批次轉化過程中產物得率會出現明顯的降低，因此需要逐批降低底物的投料質量濃度并適當延長轉化時間。

如表2所示，在第二批次轉化過程中，隨著底物質量濃度的增加，產物摩爾得率出現了明顯的下降，底物投料質量濃度為10 g/L時，轉化48 h，產物摩爾得率不足30%；投料質量濃度為8 g/L時，轉化相同的時間，產物積累的質量濃度最高為4.5 g/L，故將8 g/L作為第二批次的底物投料質量濃度。

表2 第二批次投料質量濃度對轉化的影響Table2 Effect of substrate concentration on the second batch conversion

第三批次投料質量濃度對轉化的影響如表3所示。

表3 第三批次投料質量濃度對轉化的影響Table3 Effect of substrate concentration on the third batch conversion

菌絲體在進行第三批次轉化時，投料質量濃度為2 g/L時，產物摩爾得率已低于50%；投料質量濃度增加到8 g/L，產物積累質量濃度不足1 g/L。綜合考慮生產效益，宜選用靜息細胞兩批次轉化，投料質量濃度為第一批次10 g/L（30 h），第二批次8 g/L（48 h），最終產物累計質量濃度可達12.1 g/L。

3 結語

通過對C.lini ST-1靜息細胞轉化DHEA的反應條件（包括細胞濃度、pH值、裝液量、轉速和溫度）進行單因素優化，產物摩爾得率較生長細胞提高了21.0%，表明了C.lini ST-1靜息細胞可用于DHEA的轉化生產。在上述條件優化的基礎上，考察了靜息細胞的批次轉化，得到了最佳的批次轉化條件，最終在總投料質量濃度為18 g/L時，產物的累積質量濃度達到了12.1 g/L，產物摩爾得率達到了60.5%，是目前文獻報道的最高水平。綜上，靜息細胞轉化不僅可以提高產物的摩爾得率，而且可以提高菌體的利用效率。

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Bioconversion of Dehydroepiandrosterone to 3β，7α，15α-Trihydroxy-5-Androsten-17-One by Colletotrichum lini ST-1 Resting Cells

YIN Siqi， LI Cong， WU Yan， LI Hui*， SHI Jingsong， XU Zhenghong
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The bioconversion of dehydroepiandrosterone （DHEA）to 3β，7α，15α-trihydroxy-5-androsten-17-one by Colletotrichum liniST-1 resting cells was investigated.The optimal transformation parameters in flasks were cell concentration 12 g/L，pH 6.5，liquid volume 30 mL/250 mL，rotational speed 220 r/min and temperature 30℃，which resulted in a molar product yield of 38.5%for 7α，15α-diOH-DHEA that was 20.1%higher than that from growing cells.Based on these conditions，two-batch bioconversion for 78 h with resting cells at a total substrate concentration of 18 g/L resulted in a concentration of 12.1 g/L and a molar product yield of 60.5%for 7α，15αdiOH-DHEA.

Colletotrichum lini ST-1；dehydroepiandrosterone；3β，7α，15α-trihydroxy-5-androsten-17-one；resting cells；batch conversion

Q 815

A

1673—1689（2016）08—0801—05

2015-03-11

國家863計劃重大項目（2011AA02A211）。

李 會（1983—），女，河北唐山人，工學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事生物制藥研究。E-mail：lihui@jiangnan.edu.cn