降壓類中成藥及保健食品中21種非法添加化學藥物的快速檢測與確證方法研究

陳　林，溫家欣，齊春艷，雷　毅，張　榮*

(1.廣東藥科大學　藥科學院，廣東　廣州　510006;2.廣東省藥品檢驗所，廣東　廣州　510180;3.廣東省食品檢驗所，廣東　廣州　510165)

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降壓類中成藥及保健食品中21種非法添加化學藥物的快速檢測與確證方法研究

陳林1，溫家欣2，齊春艷1，雷毅3*，張榮1*

(1.廣東藥科大學藥科學院，廣東廣州510006;2.廣東省藥品檢驗所，廣東廣州510180;3.廣東省食品檢驗所，廣東廣州510165)

采用亞3 μm色譜柱建立了降壓類中成藥及保健食品中21種非法添加化學藥物的高效液相色譜快速檢測及液相色譜-質譜聯用確證方法。樣品經甲醇-乙腈(體積比5∶5)超聲提取，采用Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)色譜柱，以甲醇-乙腈(體積比2∶1)-甲酸水溶液(pH 2.5±0.1)為流動相，梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量，液質聯用法進一步定性確證。結果表明，21種成分在17 min內完成分離，方法檢出限為0.03～0.50 mg/g，定量下限為0.09～1.50 mg/g，平均回收率為82.0%～109.0%。采用上述方法對107批從互聯網收集的樣品進行檢測，陽性檢出率為42.1%。該方法快速、準確，適用于降壓類中成藥及保健食品中非法添加藥物的快速檢測。

降壓類中成藥及保健食品；非法添加；高效液相色譜；液相色譜-質譜聯用

高血壓是一種高發性心血管疾病，同時也是導致慢性腎病、冠心病、腦中風等疾病的危險因素之一。降壓類西藥雖然療效顯著，但服用不當易產生毒副作用，需在臨床醫生指導下慎用。中藥文化在我國歷史悠久，以中草藥為原料研制成的各種中成藥、保健食品倍受患者青睞。然而不法分子為迎合消費者立竿見影的心態，在降壓類保健食品及中成藥中違法添加西藥，患者服用這些產品后可能會使血壓驟然下降或發生較大波動，甚至加重腎損害、誘發中風等疾病。

目前針對降壓類中成藥及保健食品中非法添加藥物檢測的國家標準(藥品補充檢驗方法2009032及2014008)涉及12種成分(硝苯地平、阿替洛爾、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、卡托普利、哌唑嗪、利血平、氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平)，文獻[1-6]還報道了其他多種非法添加成分(如氨苯蝶啶[3]、氯沙坦[5]、比索洛爾[6]等)。面對數量龐大的降壓類健康產品監督對象，迫切需要開發一套高通量分析方法。液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術是多數文獻報道的高通量分析方法[4-6]，但由于儀器昂貴、維護成本高，使得方法普及受限。隨著液相色譜柱填料技術的迅速發展，人們根據色譜速率理論，通過減小填料粒徑來提高柱效及克服小粒徑色譜柱的高柱壓，制成粒徑小于3 μm的亞3 μm色譜柱[7-9],既滿足了高通量分析需求,同時又憑借較低的柱壓廣泛應用于常規HPLC系統，實現了多成分的同時快速分析。因此基于亞3 μm色譜柱建立高效液相色譜快速檢測方法并配合液質聯用確證技術，對提高檢測效率和監管效能具有重要的實用意義。本文采用亞3 μm色譜柱，選擇補充檢驗方法2009032和2014008分析的12種成分及其他9種可能添加的成分作為研究對象，建立了降壓類中成藥及保健食品中21種非法添加化學藥物的HPLC快速檢測及LC-MS/MS定性確證方法。

1　實驗部分

1.1儀器與材料

Waters 2690型高液相色譜儀，2998二極管陣列檢測器(美國Waters公司)；API 5500液質聯用儀(美國AB公司)；Millipore Milli-Q純水機(美國Millipore公司)；PB-10 pH計(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；Startorious CP225D十萬分之一天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)等。

對照品：阿替洛爾、卡托普利、氫氯噻嗪、鹽酸普萘洛爾、氨苯蝶啶、硝苯地平、苯磺酸左旋氨氯地平、利血平、氯沙坦鉀、替米沙坦、尼莫地平、尼群地平、坎地沙坦酯、纈沙坦(中國食品藥品檢定研究院)，鹽酸可樂定、甲磺酸多沙唑嗪、吲達帕胺、尼索地平、鹽酸哌唑嗪、富馬酸比索洛爾、非洛地平(中國藥品生物制品檢定所)。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純)，實驗用水為超純水。

1.2溶液制備

1.2.1對照品溶液精密稱取上述21種對照品各10 mg至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇-乙腈(5∶5,體積比)配制成濃度為1.0 mg/mL的儲備液，置于2～4 ℃避光冷藏備用。臨用時，取上述儲備液用初始比例流動相稀釋配成不同濃度的標準工作液。

1.2.2供試品溶液固體樣品(丸劑與片劑研細，膠囊劑取內容物)：準確稱取0.3 g樣品置于50 mL離心管中，加入40 mL甲醇-乙腈(5∶5)，超聲提取15 min，冷卻至室溫，5 000 r/min離心5 min，取上清液轉移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻；液體樣品：精密量取10 mL樣品置于50 mL離心管中，加入30 mL甲醇-乙腈(5∶5)，超聲提取15 min，冷卻至室溫，將溶液轉移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。取提取液2 mL至10 mL容量瓶中，用流動相B(甲酸水溶液)稀釋并定容至刻度，過0.45 μm尼龍濾膜，濾液供HPLC檢測。陽性樣品溶液根據HPLC檢測結果，用流動相B適當稀釋，制成目標物濃度約為1 μg/mL的樣品溶液，過0.22 μm尼龍濾膜，濾液供LC-MS/MS檢測。

1.3HPLC條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為甲醇-乙腈(2∶1)，B為甲酸水溶液(pH 2.5±0.1)，流速：0.8 mL/min；梯度洗脫程序：0～4 min，15%～54%A；4～8 min，54%～58%A；8～10 min，58%～90%A；10～12 min，90%A；12～13 min，90%～15% A；13～17 min，15%A。檢測波長：215，270，350 nm。

HPLC法中，采用與對照品的色譜保留時間和紫外吸收光譜圖比較的方式進行定性分析；取系列標準溶液分別進樣，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸建立標準曲線，外標法進行定量分析。陽性樣品進一步用LC-MS/MS法定性確證。

1.4LC-MS/MS條件

1.4.1液相色譜條件色譜柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為甲醇-乙腈(2∶1)，B為甲酸水溶液(pH 2.5±0.1)，流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～4 min，10%～55%A；4～6 min，55%～65%A；6～8 min，65%～75%A；8～10 min，75%～90%A；10～12 min，90%A；12～13 min，90%～10% A；13～17 min，10%A。

1.4.2質譜條件電噴霧離子源(ESI)，正負離子檢測方式，采用選擇離子全掃描二級質譜模式；溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：40 psi；碰撞氣壓力：9 psi；離子噴射電壓：5 500 V(正離子模式)，-4 500 V(負離子模式)。其他質譜分析參數見表1。

表1　21種降壓藥物的質譜分析參數Table 1　MS/MS parameters of 21 antihypertensive drugs

2　結果與討論

2.1色譜柱的選擇

由于待分析的21種化合物極性差異大，文獻及補充檢驗方法采用的常規5 μm色譜柱難以在短時間內對多種成分同時快速分離，亞3 μm色譜柱由于采用實心硅核而減小了顆粒內部擴散路徑，可明顯改善色譜峰形及分離度，實現多成分快速分析。實驗分別考察了Agilent Poroshell 120 EC C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，Agilent Poroshell 120 SB C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，Kinetex C18(100 mm×4.6 mm，2.8 μm)和Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)不同鍵合相色譜柱的分離效果。結果顯示，由于卡托普利的末端吸收嚴重，其色譜峰形與信號響應較其他20種藥物差，其中，SB C18色譜柱對卡托普利的分析效果相對最好，但替米沙坦、利血平、硝苯地平的分離效果不佳。而Phenyl-Hexyl對21種化合物的分離效果最優，因此選擇Phenyl-Hexyl色譜柱進行分離。

2.2流動相的選擇

對于降壓類藥物非法添加檢測，國家標準及多數文獻[2-6]選擇“磷酸水溶液-乙腈”作為HPLC法流動相、“甲酸水溶液-甲醇”作為LC-MS/MS 法流動相。若HPLC法與LC-MS/MS法的流動相體系不同，則方法轉移時需重新開發液相色譜方法。文獻[10-11]以甲醇-乙腈(2∶1)-0.02 mol/L乙酸銨作為HPLC法及LC-MS/MS法流動相，經實驗發現，該流動相體系的分析效果優異，但阿替洛爾保留較弱，卡托普利的色譜峰信號響應較差。將乙酸銨換成甲酸水溶液后，卡托普利的色譜峰響應得到顯著改善。研究還發現，阿替洛爾的保留時間以及硝苯地平、利血平和替米沙坦3個成分之間的分離度受流動相pH值的影響較大。分別考察了甲酸水溶液pH值為2.0～5.0時對21種降壓藥物的分析效果，結果顯示，pH(2.5±0.1)時，各成分均能實現較好的分離，且阿替洛爾的保留時間與卡托普利的色譜峰信號響應均滿足分析要求。

2.3波長的選擇

卡托普利與可樂定主要在215 nm附近有吸收；吲達帕胺、氫氯噻嗪、利血平、洛爾類(阿替洛爾、比索洛爾、普萘洛爾)及沙坦類(氯沙坦、替米沙坦、纈沙坦)成分在270 nm均有吸收；氨苯蝶啶及地平類(氨氯地平、硝苯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平)成分在350 nm附近吸收較強。因此根據各成分的紫外光譜吸收特征，卡托普利和可樂定選擇215 nm，吲達帕胺、氫氯噻嗪、利血平、洛爾類及沙坦類成分選擇270 nm，氨苯蝶啶及地平類成分選擇350 nm作為檢測波長。

2.4柱溫的選擇

以卡托普利為例，考察了柱溫對色譜峰的影響，文獻發現隨著柱溫升高，卡托普利的柱效增加，當柱溫升至60 ℃時，其柱效不再隨柱溫升高而增加[12]。且柱溫過高易造成色譜柱壽命降低。經試驗，當溫度達40 ℃時，卡托普利的色譜峰響應和理論塔板數均能滿足分析要求，因此選擇柱溫為40 ℃。

2.5效能分析

按“1.3”色譜條件進樣，21種成分在17 min內可完全分離，液相色譜圖見圖1。選擇分析性能優異的ACE色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)作為傳統5 μm色譜柱代表，進樣分析。對比分析發現，21種成分在傳統5 μm色譜柱上也能獲得良好分離，但分析時間需45 min，而采用亞3 μm色譜柱可節省約62%分析時間和約70%的溶劑。

2.6線性關系、定量下限及檢出限

取系列濃度待測物標準溶液，按“1.3”液相色譜條件進樣檢測，以峰面積(y)對進樣濃度(x，μg/mL)進行回歸計算，線性回歸方程及相關系數(r2)見表2。卡托普利在5.0～100.0 μg/mL，其他20種藥物在1.0～100.0 μg/mL范圍內線性良好，r2不低于0.999 0。

取陰性樣品提取液2 mL置于10 mL容量瓶中，加入21種藥物混合對照品溶液適量，用初始比例流動相逐級稀釋，以3倍信噪比計算檢出限(LOD)，10倍信噪比計算定量下限(LOQ)，結果見表2。21種藥物的LOD為0.03～0.50 mg/g，LOQ為0.09～1.50 mg/g。

表2　21種化學藥物的線性方程、相關系數(r2)、LODs、LOQs、回收率及精密度Table 2　Linear equations,correlation coefficients(r2),LODs,LOQs，average recoveries and RSDs for 21 kind of chemical drugs

(續表2)

a:spiked 5 mg·g-1；b:spiked 10 mg·g-1；c:spiked 20 mg·g-1;peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.7回收率、精密度與穩定性

選擇陽性檢出率較高的膠囊制劑作為回收率試驗基質，精密稱取膠囊內容物0.3 g，置于50 mL容量瓶中，加入混合對照品適量，配制3個質量濃度，每個濃度水平配制6份，按“1.2.1”方法進行樣品處理后，進樣檢測。結果顯示，21種成分的回收率為82.0%～109.0%，相對標準偏差(RSD)為0.1%～3.6%(表2)。

取20 μg/mL混合對照品溶液，分別于0,4,8,12,18,24 h進樣，各成分峰面積的RSD為0.5%～1.8%，表明21種成分供試品溶液至少在24 h內穩定。

表3　12種檢出成分的檢測結果Table 3　Results of 12 kinds of detected components

2.8實際樣品的測定

從互聯網收集107批次樣品，按上述方法檢測，共發現阿替洛爾、氫氯噻嗪、卡托普利等10種成分，陽性檢出率為42.1%，檢出含量見表3。其中纈沙坦為國內首次報道；氫氯噻嗪、硝苯地平、尼群地平、氨氯地平是最常見的4種非法添加化學藥物。樣品中存在多種成分混合添加的情況，其中以“氫氯噻嗪+地平類”最為常見。雖然陽性成分的檢出含量均在單一用藥安全起效劑量范圍內，但同時攝入兩種以上降壓藥可能使血壓驟然下降或產生藥物相互作用引發其他嚴重的不良反應。

本研究還在部分樣品中檢出阿司匹林、西地那非及其水解產物水楊酸。阿司匹林可聯合降壓藥物用于治療高血壓[13-14]，西地那非用于治療肺動脈高壓[15-16]。但西地那非具有壯陽作用，阿司匹林易誘發或加重胃潰瘍，這些通過聯合用藥增強降壓作用的非法添加行為給患者帶來嚴重的安全風險。

上述結果表明，從互聯網購買的降壓類健康產品非法添加化學藥物情況比較嚴重，需加強監管。

2.9LC-MS/MS法定性確證結果

對于選擇離子全掃描二級質譜，由于受目標成分濃度和基質影響，很難采用全譜進行定性評價，因此在相同分析條件下，一般采用與標準物質溶液比較是否具有特征碎片離子峰的方法進行定性評價。圖2A為代表性陽性成分纈沙坦標準溶液的二級質譜圖，圖2B和C為經HPLC法檢測含非法添加藥物的代表性基質膠囊陽性樣品的總離子流圖與二級質譜圖。由圖2C可見樣品二級質譜圖中的選擇分子離子峰m/z436.3及碎片離子峰m/z306.4，290.9，235.2，207.0，與圖2A中纈沙坦對照品均一致，可確證該非法添加藥物為纈沙坦。

3　結　論

本文采用亞3 μm色譜柱建立了降壓類中成藥及保健食品中21種非法添加化學藥物的液相色譜高通量快速分析及LC-MS/MS定性確證方法，在降壓類保健食品中首次發現了新非法添加成分纈沙坦及其他可能用于輔助降血壓的藥物西地那非、阿司匹林。研究結果表明該方法專屬性強、靈敏度高、適用性廣，與傳統5 μm色譜柱相比，提高了檢驗效率，減低了檢驗成本，同時減少了廢液排放，對環境保護具有重要意義。

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Rapid Detection and Conformation of 21 Illegal Chemical Drugs in Antihyertension Traditional Chinese Medicine and Healthy Food

CHEN Lin1,WEN Jia-xin2,QI Chun-yan1,LEI Yi3*,ZHANG Rong1*

(1.School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou510006，China;2.Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou510180，China;3.Guangdong Institute of Food Inspection，Guangzhou510165，China)

A method was developed for the determination and conformation of 21 illegal chemical drugs in antihypertension traditional Chinese medicines and health care foods by HPLC-DAD and LC-MS/MS with sub-3 μm particle column.The samples were extracted with methanol-acetonitrile(5∶5,by volume),then separated on an Agilent Poroshell 120 phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm,2.7 μm) by gradient elution with methanol-acetonitrile(2∶1,by volume)- formic acid water solution(pH 2.5±0.1) as mobile phase,detected with DAD in wavelength range of 200-400 nm.Quantification analysis were performed by the external standard method.The positive samples were further identified and verified by LC-MS/MS.The results indicated that 21 analytes were separated completely in 17 min.The detection limits of 21 target compounds ranged from 0.03 mg/g to 0.50 mg/g.The average recoveries at three spiked levels ranged from 82.0% to 109.0%.The method was applied in the analysis of 107 batches of samples from online shopping,among which 45 batches were added with the chemicals with a positive rate of 42.1%.The method was accurate,rapid and sensitive,and was suitable for the determination of illegally added chemical drugs in traditional Chinese medicine and healthy food of antihypertension.

traditional Chinese medicine and healthy food of antihypertension;illegal;HPLC;LC-MS/MS

2016-01-26；

2016-02-17

廣東省省級科技計劃項目(2013B090200059)；廣州市健康產品非法添加化學成分快速檢測技術重點實驗室項目(2013) ；廣東省食品藥品檢驗檢測技術創新專項資金項目(2015ZX01)

雷毅，博士，主任藥師，研究方向：食品藥品檢驗，Tel：020-66808380，E-mail：Leiy04@qq.com

張榮，博士，教授，研究方向：物理藥學,E-mail：zhangr-zju@hotmail.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.002

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2016)08-0937-06