元素分析-碳同位素比值質譜法在純正葡萄汁摻假鑒別中的應用

譚夢茹，費曉慶，吳　斌，沈崇鈺，張　睿，丁　濤，劉　蕓，楊功俊*

(1.中國藥科大學　藥學院，江蘇　南京　211198;2.江蘇出入境檢驗檢疫局　食品實驗室，江蘇　南京　210001)

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元素分析-碳同位素比值質譜法在純正葡萄汁摻假鑒別中的應用

譚夢茹1，費曉慶2*，吳斌2，沈崇鈺2，張睿2，丁濤2，劉蕓2，楊功俊1*

(1.中國藥科大學藥學院，江蘇南京211198;2.江蘇出入境檢驗檢疫局食品實驗室，江蘇南京210001)

采用元素分析-同位素比值質譜法(EA-IRMS)對純正葡萄汁摻假情況進行研究。通過測定152個不同產區純正葡萄汁的碳同位素比值(δ13C值)，初步建立了純正葡萄汁的同位素數據庫。檢測結果表明，純正葡萄汁中糖的δ13C值(δ13CS)范圍為-26.92‰～-24.16‰，而有機酸的δ13C值(δ13CO)范圍為-27.56‰～-24.99‰。根據上述兩個參數，提出了純正葡萄汁應滿足的δ13C值要求：有機酸和糖的差值(Δδ13CO-S)在-1.63‰～0.72‰范圍內。采用該法對85個市售葡萄汁進行檢測，檢出31個摻入碳-4植物糖和有機酸的陽性樣品。糖漿添加實驗的結果表明，該方法可以檢測8%以上碳-4植物糖的摻假，能有效鑒別葡萄汁的摻假，在葡萄汁的品質保證方面有很大的實際應用潛力。

元素分析；同位素比值質譜；葡萄汁摻假；碳-4植物糖

葡萄含有很多活性物質，具有抗毒殺菌、抗氧化延緩衰老、抗動脈粥樣硬化等功效[1-2]。由于葡萄的營養功效逐漸得到消費者的認可，葡萄汁銷售額所占比例逐年加大[3]。與此同時，一些果汁生產企業受利益驅使對純正葡萄汁進行非法添加，果汁中的常見添加物有糖、有機酸、色素和香精。國際食品法典委員會及國家標準關于果汁的規定指出，在果汁中添加任何成分均應在標簽注明[4-5]。目前關于果汁摻假的鑒別方法主要有高效液相色譜-串聯質譜法[6]、裂解質譜法[7]、電子鼻[8]、毛細管電泳法[9]、光譜法[10]、氣相色譜-串聯質譜法[11]等。但由于果汁中內源性物質和外源性添加物質在結構和化學性質上的相似性，上述方法仍不足以很好地鑒別果汁摻假。

近年來，穩定同位素技術已發展成為解決食品摻假及產地溯源問題的一個強有力手段。目前，通過該技術實現了對各種食品的摻假鑒定(蜂王漿、油脂、葡萄酒、調味品等)以及產地溯源(如果汁、乳制品和蔬菜等)[12-15]。通過碳-3和碳-4兩種不同植物光合作用代謝途徑所得產物δ13C值的差異，可以鑒別碳-3代謝的純正葡萄汁中是否摻入碳-4代謝產物。

1　實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

Flash 2500型元素分析儀和DELTA V Advantage同位素質譜儀(美國Thermo Scientific公司)；FD115型恒溫干燥箱(德國Bingder公司)；5 mm×3.5 mm錫杯(英國Element Microanalysis公司)；RJ-LDL-50G型低速大容量多管離心機(無錫市瑞江分析儀器有限公司)；WH-861型渦旋混合器(太倉市華利達實驗設備有限公司)；JYZ-E6型榨汁機(九陽股份有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

碳同位素標準物質Beet Sugar(IA-R005，δ13C值-26.03‰，英國Sercon公司)；丙酮、硫酸、氫氧化鈣、DL-酒石酸(分析純，南京化學試劑有限公司)；蘋果酸(分析純，上海梯希愛化成工業發展有限公司)；L-酒石酸、檸檬酸(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。0.1 mol/L 硫酸溶液：取2.8 mL濃硫酸用水稀釋至500 mL。

152個葡萄樣品來自于果園和超市，均產自約北緯20°～北緯50°范圍的主要葡萄產區，包括新疆、甘肅、內蒙古、寧夏、陜西、山西、遼寧等國內產區以及法國、意大利、西班牙、智利、美國等國外產區。葡萄種類涵蓋赤霞珠、蛇龍珠、品麗珠、梅鹿輒、神索、百香、佳美、歌海娜、果若、黑品樂、佳麗釀、彌生、內比奧羅、桑嬌維塞、增芳德、巨峰、甬優一號、美人指、夏黑、酔金香等。

85個市售葡萄汁樣本來自超市或者果汁生產企業，標簽上均標明為100%葡萄汁樣本。糖漿為玉米糖漿和大米糖漿，均來自國內糖漿生產企業。

1.2樣品前處理

1)在現階段高速公路風險管理中安全文化尚未完全體現其重要性，仍僅局限于傳統安全教育培訓. “知行合一”的哲學觀念要求，風險管理理念與風險管理實踐要居于同等重要的地位，風險管理的發展需要先進安全文化的支撐.

選取新鮮、飽滿、無病斑、整粒的葡萄，去皮去籽，放入榨汁機中榨取純正葡萄汁。樣品前處理過程部分參考果汁中糖和果肉δ13C值的檢測標準[16-17]。

取50 mL葡萄汁樣品，于3 000 r/min離心5 min后取上清液，以除去果汁中的固體果肉成分。上清液中加入2.0 g氫氧化鈣，并在90 ℃水中煮3 min以沉淀有機酸。再以3 000 r/min離心5 min，所得上清液和沉淀分別用于果汁中δ13CS和δ13CO的測定。

果汁中δ13CS的測定：所得上清液用0.1 mol/L 硫酸溶液調至pH 5.0，于4 ℃過夜沉淀，用5 μL微量進樣器移取1 μL上清液至5 mm×3.5 mm錫杯中，待測。

果汁中δ13CO的測定：所得有機酸沉淀用40 mL水洗3次(以除去殘留糖)，然后用40 mL丙酮洗3次(以除去脂質)，所得沉淀于75 ℃下恒溫干燥后，稱取約0.1 mg至5 mm×3.5 mm錫杯中，待測。

每個樣各組分平行測定2次，取平均值，絕對差小于0.30‰。

1.3實驗條件

1.3.1元素分析儀條件氧化管溫度：950 ℃；還原管溫度：680 ℃；氣相色譜柱溫箱溫度：50 ℃；載氣：高純氦氣，流速：120 mL/min；燃燒氣：高純氧氣，流速：100 mL/min；燃燒時間：3 s。

1.3.2同位素質譜條件離子源：電子轟擊離子化(EI)；氦氣壓力：1.0 bar；參考氣二氧化碳壓力：1.0 bar；離子源電壓：2.97 kV；真空度：1.8×10-6mbar。

2　結果與討論

樣品的δ13C值由Isodat 3.0軟件直接給出。δ13C值的計算基于國際標準物質Vienna peedee belemnite standard(VPDB)[18]，計算公式為：δ13C=(Rsample-RVPDB)/RVPDB×1 000，其中Rsample為樣品的13C與12C的同位素比值13C/12C，RVPDB=0.011 237 2。

在測定樣品時，每間隔10個樣品需測定1次碳同位素標準物質Beet Sugar進行系統穩定性評價，要求所測得的δ13C值與證書標明值相差小于0.30‰。

2.1葡萄汁中糖及有機酸分離過程的優化

純正葡萄汁的主要成分是糖和有機酸。由于來源相同的各個組分的δ13C值十分接近，所以純正葡萄汁中糖和有機酸的δ13C值差異較小，而摻入碳-4植物來源的糖或有機酸均會造成二者的δ13C差值增大，使得該參數超出合理范圍，因此本研究需將糖和有機酸兩者有效分離來進行測定。

通過加入氫氧化鈣與有機酸反應形成沉淀后離心，上清液中為糖，沉淀為有機酸鈣鹽，從而實現兩者的分離。氫氧化鈣加入量過少會使有機酸沉淀不完全，進而影響糖的δ13C值測定，而加入量過多則會造成試劑浪費。因此，本文對氫氧化鈣的加入量進行了優化。選取1個純正葡萄汁樣本，在初步離心除去果肉后的50 mL澄清樣品中加入氫氧化鈣(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g)，分別測定δ13CS和δ13CO。結果表明，在不同加入量情況下，δ13CO值的變化很小，其值為-26.34‰～-26.18‰。當加入量為1.0 g和1.5 g時，δ13CS值相對明顯偏負(-25.47‰～-25.39‰)，這是由于有機酸未完全沉淀，上清液中含有δ13C值相對偏負的有機酸，當加入量為2.0 ～3.0 g時，糖的δ13CS值趨于穩定(-24.74‰～-24.52‰)，表明有機酸已完全沉淀。因此實驗選取氫氧化鈣的加入量為2.0 g。

2.2EA-IRMS法測定純正葡萄汁

采用EA-IRMS法對152個純正葡萄汁的δ13CS和δ13CO進行測定，所得結果如圖1，可以看出純正葡萄汁中δ13CS范圍為-26.92‰～-24.16‰，而δ13CO的范圍為-27.56‰～-24.99‰，兩個參數的結果大致呈正態分布且表現出典型的碳-3代謝產物特征。計算得Δδ13CO-S在-1.63‰～0.72‰范圍內，而可能摻入的碳-4代謝產物的典型δ13C值一般在-20‰～-9‰范圍內，一旦其摻入純正葡萄汁中將會使Δδ13CO-S超出上述合理范圍。

為了驗證方法重現性，選取1個純正葡萄汁，連續15 d檢測該樣本的δ13CS和δ13CO值，計算所得的相對標準偏差(RSD)分別為0.20%和0.21%，可見本方法的數據重現性較好，能滿足葡萄汁中糖和有機酸δ13C值的檢測要求。

2.3EA-IRMS法在純正葡萄汁摻假鑒別中的應用

2.3.1常見糖漿及糖漿摻假葡萄汁的測定選取2種常見的糖漿(大米糖漿和玉米糖漿)進行摻假鑒別研究，其中大米糖漿為碳-3植物糖，而玉米糖漿為碳-4植物糖。在1個純正葡萄汁樣本中分別摻入大米糖漿和玉米糖漿，摻入比例均為15%，標為摻假葡萄汁1和摻假葡萄汁2。采用EA-IRMS測定兩個樣本的δ13CS，δ13CO和Δδ13CO-S，結果顯示，摻假葡萄汁1的δ13CS相對于純正葡萄汁偏正，導致Δδ13CO-S為-4.85‰，超出純正葡萄汁的Δδ13CO-S合理范圍(-1.63 ‰～0.72 ‰)。而摻假葡萄汁2的Δδ13CO-S未超出上述范圍，因此，本方法對于碳-4來源的糖漿摻假有很好的鑒別能力，而對于碳-3來源的糖漿摻假則需進一步研究。

為了進一步驗證方法的有效性，選取1個純正葡萄汁與1個玉米糖漿(δ13C=-14.56‰)按照不同的比例混合，分別測定該樣的δ13CS，δ13CO和Δδ13CO-S值。從圖2可以看出，當摻入玉米糖漿比例達8%時，計算得Δδ13CO-S<-1.63‰，即被鑒定為摻入碳-4植物糖。因此當摻糖比例不低于8%時，采用本方法即可被檢出。

2.3.2常見有機酸及有機酸摻假葡萄汁的測定葡萄汁中含量較高的有機酸包括酒石酸、蘋果酸和檸檬酸，含量分別約為0.3%，0.15%和0.14%[19-21]。選取上述3種有機酸進行研究。首先采用EA-IRMS測定了L-酒石酸、DL-酒石酸、蘋果酸和檸檬酸的δ13C值，測定結果分別為-19.36‰，-27.07‰，-25.6‰和-11.15‰。分別將L-酒石酸、DL-酒石酸、蘋果酸、檸檬酸摻入1個純正葡萄汁中，摻入比例分別為0.3%,0.3%，0.15%和0.14%，記為自制1～4(Self-made 1～4)。采用EA-IRMS測定這4個樣本的δ13CS,δ13CO和Δδ13CO-S，結果見表1。

表1自制摻假葡萄汁中糖和有機酸的δ13C值

Table 1δ13CSandδ13COresults of self-made adulterated grape juice

/‰

從表1可以看出，摻入碳-3來源的自制2、自制3摻假葡萄汁的Δδ13CO-S未超出-1.63‰～0.72‰限定范圍，而其他2個自制摻假葡萄汁樣本的Δδ13CO-S均超出限定范圍，被本方法有效鑒別?？梢?，本方法對于碳-4來源的有機酸摻假同樣有效，但無法有效鑒別碳-3來源的有機酸摻假。

目前已有研究采用LC/EA-IRMS對碳-3來源的糖漿摻假進行鑒別[22],本課題組擬用LC/EA-IRMS對碳-3植物來源摻假進行后續鑒別研究。

2.3.3市售葡萄汁樣品的測定根據上述葡萄汁摻假鑒別新方法，采用EA-IRMS對市售標明100%純葡萄汁樣品的真偽情況進行研究，85個樣本采自超市或果汁生產企業。結果檢測出陽性樣品31個，陽性率達36.47%。

3　結　論

本文利用EA-IRMS法初步建立了純正葡萄汁的碳同位素數據庫，提出了鑒別葡萄汁摻假的新技術，通過對純正葡萄汁的糖、有機酸的δ13C值進行測定，進一步分析二者δ13C值的差異，該方法能有效地鑒別出葡萄汁摻入的外源性碳-4植物糖和有機酸。對市售葡萄汁樣品進行了檢測，陽性檢出率為36.47%，雖然對碳-3植物糖和有機酸的摻假檢測性能有待改善，但新方法在葡萄汁摻假鑒別的靈敏度方面顯示了較大優勢，有較好的應用前景。

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Identification of Authentic Grape Juice Adulteration Using Elemental Analysis-Carbon Isotope Ratio Mass Spectrometry

TAN Meng-ru1,FEI Xiao-qing2*,WU Bin2,SHEN Chong-yu2,ZHANG Rui2,DING Tao2,LIU Yun2,YANG Gong-jun1*

(1.College of Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing211198,China;2.Laboratory of Food,Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing210001,China)

A new research for authentic grape juice adulteration identification using elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry(EA-IRMS) was developed.The carbon isotope ratio values(δ13C values) for 152 grape samples from different production regions were collected to primarily construct the isotopic database of authentic grape juices.The results indicated that theδ13C values of sugar and organic acid were in the ranges of -26.92‰-24.16‰ and-27.56‰-24.99‰，respectively.Based on the aboveδ13C values collected,theδ13C value limit for the authentic grape juice was proposed:theδ13C difference between organic acid and sugar Δδ13CO-Sshould be from-1.63‰ to 0.72‰.According to the above criteria,among 85 commercial samples,31 samples were confirmed adulterated with C-4 plant sugar or organic acid.According to the syrup addition test,EA-IEMS method could identify over 8%C-4 plant sugar adulteration.The newly developed method represented a significant potential application in the quality assurance of grape juice.

elemental analyzsis;isotope ratio mass spectrometry;grape juice adulteration;C-4 plant sugar

2015-12-10；

2016-02-15

江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(2015KJ31)；國家自然科學基金資助項目(21275162)；“青藍工程”資助項目

楊功俊，博士，教授，研究方向：現代儀器分析，Tel：025-84589700，E-mail：gjyang@cpu.edu.cn

費曉慶，碩士，工程師，研究方向：食品分析與食品摻假鑒別，Tel：025-52345193，E-mail:dii01208@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.018

O657.63;S663.1

A

1004-4957(2016)08-1031-05