高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大米與小米中柄曲霉素殘留

趙亞榮，石階平，黃健祥,王富華*

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　廣州　510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院　農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心，廣東　廣州　510640；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)　食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京　100083)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大米與小米中柄曲霉素殘留

趙亞榮1,2,3，石階平3，黃健祥1,2,王富華1,2*

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心，廣東廣州510640；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

通過優(yōu)化提取溶劑及其體積、超聲時(shí)間及吸附劑，建立了一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確測(cè)定大米和小米中柄曲霉素的分析方法。以乙腈為提取溶劑，乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附劑凈化，上清液過膜后進(jìn)行分析，在電噴霧電離(ESI)模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，柄曲霉素在0.1～100.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)不低于0.999 0。大米中柄曲霉素的檢出限為0.03 μg/kg，定量下限為0.1 μg/kg，回收率為88.3%～91.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～6.0%；小米中柄曲霉素的檢出限為0.1 μg/kg，定量下限為0.3 μg/kg，回收率為92.7%～103.8%，RSD為2.2%～6.9%，符合痕量分析的要求。采用該方法分析收集的大米和小米樣品，均未檢出柄曲霉素。

柄曲霉素；大米；小米；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)

柄曲霉素(Sterigmatocystin，STC)是由雜色曲霉(Aspergillusversicolor)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有潛在的致癌性、致突變性和致畸性。其結(jié)構(gòu)與黃曲霉毒素B1(AFB1)高度相似(如圖1)，基本結(jié)構(gòu)組成為二呋喃環(huán)和氧雜蒽酮[1]。食物、飼料、屋內(nèi)污垢物品是真菌產(chǎn)生STC的主要載體，一些植物和哺乳動(dòng)物病原體也會(huì)導(dǎo)致STC的產(chǎn)生[2]。研究表明，在大鼠和猴子體內(nèi)，STC的致死劑量約為AFB1的1/10；STC在大鼠體內(nèi)引起肝癌所需的劑量比AFB1低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[3]。因此，國(guó)家癌癥研究中心(IARC)將其分為2B級(jí)致癌物[4]。大米作為我國(guó)的主糧之一，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；小米作為健康食品，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富。二者在生產(chǎn)、加工及儲(chǔ)存過程中均可能受到真菌污染，產(chǎn)生真菌毒素，因此，有必要建立一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速分析大米和小米中柄曲霉素的方法以保障消費(fèi)者健康。

目前檢測(cè)柄曲霉素的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和色譜法。ELISA靈敏度高，特異性好，提取方法簡(jiǎn)單，回收率好，一次實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)多個(gè)樣品；但由于STC在樣品中含量低，免疫原性弱，存在交叉反應(yīng)且特異性抗體制備困難，使其在STC含量檢測(cè)中應(yīng)用較少[5-6]。而色譜法主要包括薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[7-11]。TLC由于操作簡(jiǎn)單、所用試劑便宜等優(yōu)點(diǎn)，曾廣泛用于真菌毒素檢測(cè)。中國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)的食品中STC檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法即為TLC技術(shù)[12]，但該方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度較差、無法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn)，且柄曲霉素自身熒光性較弱，檢測(cè)時(shí)需衍生，操作復(fù)雜，易產(chǎn)生干擾，因此目前應(yīng)用較少。HPLC-MS/MS具有選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，近幾年成為廣泛應(yīng)用的定量檢測(cè)方法。樣品前處理作為檢測(cè)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)降低基質(zhì)效應(yīng)、提高方法的準(zhǔn)確度和靈敏性起著關(guān)鍵性作用。因此，高效的樣品凈化技術(shù)成為痕量分析的重要因素?；诳乖贵w反應(yīng)的免疫親和柱(IAC)盡管能夠保證基質(zhì)凈化效果以及準(zhǔn)確檢測(cè)微痕量目標(biāo)物[13]，但其價(jià)格較高。本研究結(jié)合操作簡(jiǎn)單、成本低的QuEChERS前處理過程，采用HPLC-MS/MS技術(shù)，建立了一種高效、快速、準(zhǔn)確的柄曲霉素定量分析方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1樣品、儀器與試劑

大米和小米樣品購自超市。取約500 g樣品打碎，過20目篩，置于干燥環(huán)境中備用。

高效液相色譜儀(LC-30AD)、帶電噴霧離子源三重四極桿質(zhì)譜儀(LCMS-8050)，XR-ODS Ⅲ C18色譜柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)均購自日本島津公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器(A10 System，美國(guó) Millipore 公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜(天津津騰公司)；AL204電子分析天平(上海梅特勒-托利多公司)；YB-600A高速多功能粉碎機(jī)(浙江運(yùn)邦公司)；H2050R高速離心機(jī)(湖南湘儀公司)；HU20500B超聲儀(天津恒奧公司)；QL-866渦旋儀(海門其林貝爾公司)。柄曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，美國(guó)Sigma公司)；乙腈(HPLC級(jí)，美國(guó)Merck公司)；甲酸(純度≥98%，質(zhì)譜用，美國(guó)Sigma公司)；氯化鈉和無水硫酸鎂均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1柄曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用乙腈溶解5 mg柄曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成500 mg/L的柄曲霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃保存。

1.2.2樣品提取與凈化稱取大米和小米樣品各5.0 g(精確至0.01 g)，分別置于50 mL離心管中，加入柄曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下放置過夜后取出，加入25 mL乙腈，旋渦1 min，超聲7 min，加入1 g無水MgSO4和1 g NaCl，旋渦1 min，離心5 min(4 500 r/min)。取上清液，加入50 mg PSA，旋渦1 min，離心5 min(4 500 r/min)。取上清液，過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS檢測(cè)。

加標(biāo)樣品：稱取5.0 g(精確至0.01 g)空白樣品，按照上述過程提取，用提取上清液配制濃度依次為0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3實(shí)驗(yàn)條件液相色譜條件：XR-ODS Ⅲ C18色譜柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～6 min，10%～95% B；6～6.1 min，95%～10% B；6.1～9 min，10% B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源接口溫度300 ℃；脫溶劑溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；霧化氣流速3 L/min；加熱氣流速10 L/min；干燥氣流速10 L/min；使用[M+H]+(m/z324.6)作為母離子,子離子分別為310.0(25 eV)和281.0(36 eV)，其中m/z310.0為定量離子。

2　結(jié)果與討論

2.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

合適的樣品前處理可達(dá)到去除基質(zhì)干擾、富集目標(biāo)物、定量轉(zhuǎn)換等目的[14]。提取過程中加入無水硫酸鎂和氯化鈉能夠產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，使基質(zhì)中親水性成分的溶解度降低，促使溶劑相和水相分離，從而提高提取效率，此外，已有研究表明，一些吸附劑的加入會(huì)造成部分目標(biāo)物的損失[15]。本研究分別從提取劑組成和體積、超聲時(shí)間、吸附劑類型等方面對(duì)前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1提取溶劑及體積的影響提取劑對(duì)樣品回收率的影響較大，真菌毒素的常用提取溶劑有乙腈、甲醇、乙腈-水以及甲醇-水。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在相同樣品中添加同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用乙腈作為提取劑時(shí)回收率較甲醇高[9-10]。參照上述文獻(xiàn)，本文分別以乙腈、乙腈-水(84∶16，90∶10)混合溶液作為提取溶劑，對(duì)加標(biāo)濃度為100 μg/kg的大米樣品按“1.2.2”方法進(jìn)行處理后，采用HPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，以乙腈為提取溶劑時(shí)，柄曲霉素的提取效果最佳。而以乙腈-水(84∶16)為提取溶劑時(shí)，柄曲霉素的回收率達(dá)140%，這與Versilovskis 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同[8,16]。進(jìn)一步考察了不同體積(10，20，25 mL)乙腈提取時(shí)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)乙腈體積為25 mL時(shí)，樣品的提取效果最好，回收率為105.6%。

2.1.2超聲時(shí)間的影響在相同條件下，考察了提取超聲時(shí)間(3,5,7,10 min)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示，柄曲霉素的回收率分別為91.4%，93.2%，94.5%和95.1%，回收率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。但當(dāng)超聲時(shí)間超過7 min后，回收率增加不明顯，且延長(zhǎng)超聲時(shí)間會(huì)使超聲儀中的水溫升高，影響目標(biāo)化合物的回收率。綜合考慮樣品處理時(shí)間等因素，最終選擇7 min作為超聲時(shí)間。

2.1.3吸附劑的影響考察了C18、弗羅里硅土、石墨化碳黑和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA) 4種吸附劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，PSA作為吸附劑時(shí)，樣品中柄曲霉素的回收率最好。這是由于PSA具有弱的陰離子交換能力，主要通過氫鍵與化合物結(jié)合，可有效吸附脂肪酸、部分色素、糖和有機(jī)酸，此外PSA還同時(shí)具有一級(jí)和二級(jí)胺，與化合物的結(jié)合能力最強(qiáng)。而當(dāng)以石墨化碳黑作為吸附劑時(shí)，回收率最差。這可能是因?yàn)槭己诘谋砻媪呅谓Y(jié)構(gòu)使其對(duì)平面分子或含有平面芳香環(huán)的分子具有強(qiáng)烈的吸附作用，由于柄曲霉素結(jié)構(gòu)中含有呋喃環(huán)，因此可被石墨化碳黑吸附從而使柄曲霉素的回收率降低。弗羅里硅土是硅膠鍵合氧化鎂的吸附劑，與硅膠相似，是強(qiáng)極性吸附劑，主要適用于脂肪量高的樣品。C18吸附劑是硅膠基質(zhì)上接有十八烷基，具有較高的碳含量，可去除大量的油脂和非極性物質(zhì)，常被用作凈化劑[17]。綜合回收率和RSD結(jié)果，最終選擇PSA作為吸附劑。

2.2工作曲線、檢出限與定量下限

以樣品空白提取液配制柄曲霉素濃度在0.1～100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以HPLC-MS/MS的峰面積為縱坐標(biāo)(y)、以基質(zhì)標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比作為方法的檢出限(LOD)，以10倍信噪比作為方法的定量下限(LOQ)。得出大米基質(zhì)的線性方程為y=26 915x+15 548，r2=0.999 0，LOD為0.03 μg/kg，LOQ為0.1 μg/kg；小米基質(zhì)的線性方程為y=21 009x+15 031，r2=0.999 0，LOD為0.1 μg/kg，LOQ為0.3 μg/kg。圖3為大米加標(biāo)樣品10 μg/kg的色譜圖。

2.3回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

稱取大米、小米樣品各5 g，分別置于50 mL離心管中，添加柄曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦混勻，使其在大米和小米中的加標(biāo)水平為定量下限的1倍、5倍和10倍，室溫放置，過夜。依照“1.2.2”方法進(jìn)行樣品前處理，利用HPLC-MS/MS分析。每個(gè)樣品做5個(gè)平行，計(jì)算其加標(biāo)回收率。結(jié)果見表1，大米中柄曲霉素的回收率為88.3%～91.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～6.0%；小米中柄曲霉素的回收率為92.7%～103.8%，RSD為2.2%～6.9%。方法的準(zhǔn)確度及精密度符合定量分析要求。

2.4日間精密度

稱取大米、小米樣品各5 g，添加STC標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中STC的含量為100 μg/kg，按照“1.2.2”方法進(jìn)行前處理并采用HPLC-MS/MS分析，每隔3 d平行測(cè)定1次，每個(gè)樣品做5個(gè)平行，測(cè)得大米和小米樣品的方法日間精密度分別為6.0%和7.4%。

2.5實(shí)際樣品分析

分別對(duì)采集自黑龍江的2013年20份大米樣品、廣東省的2013年40份大米樣品、廣東省的2014年40份大米樣品及內(nèi)蒙古、山西等地不同年份26份小米樣品進(jìn)行測(cè)定，所有樣品均未檢出柄曲霉素。來自黑龍江的樣品于-18 ℃保存兩年，保存溫度偏低，不利于產(chǎn)毒素菌株的生長(zhǎng)和代謝；而廣東省80份樣品均保存在干燥、通風(fēng)的環(huán)境中，同樣不利于真菌的生長(zhǎng)。小米樣品中，有保存3年及3年以上的樣品，其中部分肉眼可見已發(fā)霉，但未檢出柄曲霉素，這可能是因?yàn)樾∶字姓婢x未產(chǎn)生柄曲霉素或柄曲霉素含量低于本方法檢出限。

3　結(jié)　論

建立了大米和小米中柄曲霉素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單快速，其準(zhǔn)確度、精密度、線性關(guān)系和靈敏度滿足真菌毒素的分析要求，為提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平提供了良好的技術(shù)支持。

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[17]Yi J H,Duan Z J,Fang G Z,Cao M R,Wang S.Int.J.FoodSci.Technol.(易江華,段振娟,方國(guó)臻,曹梅榮,王碩.中國(guó)食品學(xué)報(bào)),2013,13(2):153-158.

Determination of Sterigmatocystin in Rice and Millet by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Ya-rong1，2，3,SHI Jie-ping3,HUANG Jian-xiang1,2,WANG Fu-hua1,2*

(1.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Agro-product Safety and Quality,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510640,China；2.Public Monitoring Center for Agro-product of Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou510640,China；3.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing100083,China)

Sterigmatocystin,a mycotoxin produced by fungi and widely distributed in cereal food,has a potential toxic effect to human and animals with risk on food safety.In this study,a rapid,simple and accurate high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was established for the analysis of sterigmatocystin in rice and millet by optimizing extraction solvent and its volume,ultrasonic time and adsorbent.The samples were extracted with acetonitrile,and cleaned up with PSA,then detected after the supernatant was filtered through nylon filter.The detection was performed in the electrospray ion(ESI) positive mode and multiple reaction monitoring(MRM) mode.The sterigmatocystin showed good linear relationships in the range of 0.1-100.0 μg/L with correlation coefficients not less than 0.999 0．The limit of detection(LOD) and the limit of quantitation(LOQ)for sterigmatocystin in rice were 0.03 μg/kg and 0.1 μg/kg,respectirely,the recoveries ranged from 88.3% to 91.5% with relative standard deviations(RSDs) of 2.3%-6.0%.The LOD and LOQ for sterigmatocystin in millet were 0.1 μg/kg and 0.3 μg/kg,respectively,and the recoveries were 92.7%-103.8% with RSDs of 2.2%-6.9%.The proposed method could meet the requirement for trace analysis.The method was applied in the the detection of the collected rice and millet samples,and no sterigmatocystin was detected.

sterigmatocystin;rice;millet;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2016-01-04；

2016-01-26

農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(NK201501)

王富華，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，Tel：020-85161430，E-mail：wfhwqs@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.020

O657.63;S852.44

A

1004-4957(2016)08-1041-05