一種檢測生物硫醇熒光探針的合成與應用

陳　頌，王　靜，侯　鵬，劉　磊，王　鑫

(齊齊哈爾醫學院　藥學院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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一種檢測生物硫醇熒光探針的合成與應用

陳頌*，王靜，侯鵬，劉磊，王鑫

(齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾161006)

基于硫醇誘導的邁克爾加成反應阻斷探針的光誘導電子轉移過程(PET)合成了一種基于氟化硼絡合二吡咯甲川(Bodipy)類染料的熒光探針，該探針具有高靈敏度和選擇性，可在生理條件下檢測硫醇。利用核磁和高分辨質譜對探針結構進行了表征。當向探針溶液加入硫醇(0～1 000 μmol/L)時，可在探針溶液的綠色光譜區域引起一個顯著的熒光增強響應(增強至150倍)。同時，探針可以檢測相對較低濃度的硫醇，對于含有硫醇的氨基酸(半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸)的檢出限分別為4.5×10-7，1.2×10-7，2.1×10-7mol/L。此外，相對于其他氨基酸，探針對硫醇具有較高的選擇性和靈敏度。該方法成功實現了細胞內硫醇的熒光成像，證明該熒光探針在生物體系中具有潛在的應用能力。

合成;應用;熒光探針;檢測;生物硫醇

生物硫醇(如半胱氨酸、同型半胱氨酸和三肽化合物谷胱甘肽)可參與可逆的氧化還原反應過程，調節生化途徑中的細胞穩態和細胞代謝，近年來受到了人們極大的關注。半胱氨酸的缺乏會導致各種健康問題，如生長遲緩、毛發色素脫失、嗜睡、肝臟和皮膚組織損傷以及脂肪損失[1-4]。作為最豐富的細胞內的非蛋白硫醇，谷胱甘肽以氧化還原調節器的角色在維持細胞還原環境的過程中發揮著舉足輕重的作用，包括保持蛋白質中的半胱氨酸處于還原狀態，以及通過捕獲易損傷DNA和RNA的自由基保護細胞免受氧化應激影響[5-9]。因此，檢測細胞內硫醇的含量對細胞功能的研究具有重要意義。與其他檢測技術相比，光學檢測是一種操作比較簡單的分析方法。其中，熒光分析法由于具有操作簡單、檢測靈敏以及適于細胞內檢測的優勢而備受關注[10-12]。

盡管研究人員已設計合成了許多識別硫醇的熒光探針[13-19]，但開發一種高選擇性、高靈敏度、同時能夠應用于生物成像的熒光探針，仍是廣大科研工作者關注的熱門課題。氟化硼絡合二吡咯甲川(Bodipy)類熒光染料，又名氟硼熒，是一類非常優秀的新型染料，其分子的高度剛性使之具有非常優良的光物理性能，如，較高的摩爾消光系數(ε>80 000 cm-1·M-1)和熒光量子產率(0.6以上)，較好的光穩定性，其光譜不易受溶劑極性、pH值以及激發光降解的影響，確保了其在熒光分析過程中獲得的光譜信息完全來源于被測試物[20-22]。本文合成了以Bodipy染料為信號表達基團、硝基烯烴部分作為潛在反應位點的選擇性硫醇熒光探針，并將其用于生物體系內硫醇的檢測。在探針分子1中，引入硝基烯烴作為光誘導電子轉移過程(PET)中電子的受體時，探針的水溶液幾乎無熒光，當加入硫醇(RSH)后，硫醇進攻硝基烯烴的雙鍵，進行邁克爾加成反應，導致原有的PET過程被中斷，使探針的熒光恢復(圖1)。利用反應前后熒光光譜的變化，建立了一種熒光識別硫醇的分析方法。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Bruker AV400波譜儀(300 MHz)、Bruker microTOF-Q Ⅱ高分辨質譜(美國Bruker公司)，F4600-熒光分光光度計(日本日立公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Nikon Eclipse TE300)。

硝基甲烷、醋酸(國藥集團化學試劑有限公司)，哌啶(天津市福晨化學試劑廠)，石油醚(天津市東麗區天大化學試劑廠)，二氯甲烷(天津市凱通化學試劑有限公司)，測試用氨基酸(上海國藥試劑有限公司)：半胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，丙氨酸(Ala)，纈氨酸(Val)，苯丙氨酸(Phe)，組氨酸(His)，亮氨酸(Leu)，絲氨酸(Ser)，異亮氨酸(Ile)，色氨酸(Trp)，賴氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)，脯氨酸(Pro)，甘氨酸(Gly)，甲硫氨酸(Met)，酪氨酸(Tyr)，天冬酰胺(Asn)，谷氨酸(Glu)，蘇氨酸(Thr)，上述試劑均為分析純。

1.2探針的合成與表征

在氬氣保護下，將化合物2[23](70 mg，0.2 mmol)和硝基甲烷(50 mg，0.8 mmol)溶于10 mL甲苯中，加入哌啶和醋酸各1滴，回流2 h，待反應完成后，降至室溫，將反應液倒入水中，以二氯甲烷(3×25 mL)萃取，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離(石油醚∶二氯甲烷=1∶1)得到產品(53 mg，收率 68%)，即為探針分子1。1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ8.03(d，J=13.7 Hz，1H)，7.55(s，3H)，7.39-7.27(m，3H)，6.16(s，1H)，2.71(s，3H)，2.62(s，3H)，1.47(s，3H)，1.42(s，3H)。 HRMS Calcd for:395.162；Found:395.191。

1.3光譜分析測試

稱取適量的熒光探針1溶解于乙腈中，配制成1.0×10-3mol/L儲備液，4 ℃冷藏保存，測試物經去離子水溶解，配成1.0×10-2mol/L溶液。20 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.4，50% CH3CN)測試體系的配制：將0.003 mL熒光探針1儲備液加至1.497 mL乙腈中，再加入0.3 mL被測物質溶液，最后用HEPES緩沖液(pH 7.4)定容至3 mL，混合均勻，測定其光譜。熒光分光光度計參數：λex=506 nm，λem=520 nm，狹縫寬度均為5 nm，電壓為700 V，靈敏度為2。

1.4細胞培養與成像

將HeLa細胞放在含有10% 胚胎血清的DMEM培養液中，5% CO2的條件下，37 ℃無菌培養24 h，將其接種至12孔細胞培養板內繼續無菌培養過夜，經PBS緩沖液漂洗3次，加入探針1至終濃度為5 μmol/L，孵化30 min，經PBS緩沖液漂洗3次，置于Nikon Eclipse TE300熒光倒置顯微鏡進行成像。空白對照試驗：在相同條件下，向HeLa細胞中預先加入N-甲基馬來酰亞胺(1 mmol/L)，37 ℃孵化30 min，經PBS緩沖液漂洗3次，再加入探針1，孵化30 min，經PBS緩沖液漂洗3次，置于熒光顯微鏡下進行成像。

2　結果與討論

2.1熒光光譜研究

如圖2所示，隨著Cys的加入，探針1溶液在520 nm處的熒光顯著增強，當加入(1 000 μmol/L)Cys時，熒光強度增強至150倍，在相同的測試條件下，將探針1(1 μmol/L)分別與Hcy和GSH作用均可觀察到以上相似的實驗結果。通過分析探針1與不同濃度(0～80 μmol/L)生物硫醇反應的熒光發射光譜數據，并對其進行擬合后得到Cys,Hcy,GSH的方程分別為y=41.98+11.19x(r=0.999 7)，y=104.08+43.48x(r=0.998 8)，y=49.13+24.49x(r=0.999 7),式中y為熒光強度，x為生物硫醇濃度(μmol·L-1)。計算得其檢出限分別為4.5×10-7，2.1×10-7，1.2×10-7mol/L。在活體細胞中，生物硫醇的含量一般在10-6～10-3mol/L之間，因此，該熒光探針的靈敏度符合細胞水平中硫醇定量檢測的要求。

2.2選擇性與干擾實驗

為了評估探針1對生物硫醇的專一識別能力，本文選取常見的氨基酸、典型的金屬離子以及氧化還原劑作為測試物(Cys，Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，Ile，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Asn，Glu，Thr，K+，Na+，Mg2+，Ca2+，Glucose，AA，H2O2，NADH)，測定了不同測試物(200 μmol/L)與探針1(1 μmol/L)混合后的熒光恢復比值。結果顯示，探針1對含有巰基的氨基酸(Cys)具有很高的選擇性，僅在二者反應后于520 nm處表現出明顯的熒光比值增強(R=(IF-IF0)/IF0≈40)，而在生物體系的硫醇檢測中，其他測試物的存在對探針溶液的熒光行為均未造成影響(R≈0)。為進一步評估探針1對生物硫醇的高度選擇性，在其他測試物存在下，進行了干擾實驗的研究。結果表明，除H2O2對探針1識別Cys產生輕微干擾外(R≈33)，其他測試物均不影響探針1對生物硫醇的檢測(R≈40)。而且，探針分子溶液對巰基氨基酸具有專一的顏色變化。因此，探針1在模擬的生理狀態下對生物硫醇顯示出極高的選擇性，并能夠有效抵抗其他氨基酸的干擾。

2.3pH值的影響

研究表明，人體體液的酸堿度波動范圍一般為pH 6.8～7.5，因此，設計在較寬的范圍內對生物硫醇具有穩定識別能力的探針將十分符合現實需求。實驗考察了pH值對體系熒光強度的影響(見圖3)。結果顯示在pH 2.0～10.0范圍內，探針分子溶液的熒光強度幾乎一致，不同的pH值不會使探針的光學性質產生變化，在pH 11.0～12.0范圍內，熒光略有增強是由于探針分子在堿性條件下分解。然而，當探針1(1 μmol/L)中加入Cys(200 μmol/L)后，由pH 2.0增至pH 4.0時，溶液的熒光強度隨之增強，在pH 5.0～11.0范圍內熒光強度相對穩定。考慮到熒光響應最大以及實際應用的可能，本文選擇生理pH 7.4 作為研究體系的pH值。

2.4熒光成像

為了實現細胞內生物硫醇的檢測，選用人源宮頸癌傳代細胞(HeLa)探討探針1對生物硫醇的熒光成像實驗，結果如圖4所示。由于腫瘤細胞含有一定量的硫醇氨基酸維持細胞活性，因此將HeLa細胞在探針1中孵育后，通過熒光顯微鏡可觀察到顯著的黃色熒光，然而，將HeLa細胞預先用巰基阻斷劑N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)處理后，再在探針1中孵育，此時在細胞內只觀察到微弱的熒光，說明觀察到的黃色熒光是由于細胞內存在的含硫醇物質與探針作用所致。細胞內硫醇熒光成像實驗證明，探針1具有檢測生物體系內硫醇的可行性。

3　結　論

本文合成了一種Bodipy染料作為熒光母體識別生物硫醇(Cys，Hcy，GSH)的新型熒光探針。相對于其他氨基酸，該探針對含硫醇的氨基酸顯示出較高的選擇性和專一性。熒光增強主要是由于硫醇進攻硝基烯烴的雙鍵，發生邁克爾加成反應，中斷了體系的PET作用。同時，HeLa細胞的熒光成像實驗也證明了探針具有檢測生物體系內硫醇的能力。

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Synthesis of a Fluorescent Probe and Its Application in Thiols Determination

CHEN Song*，WANG Jing，HOU Peng，LIU Lei，WANG Xin

(College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar161006，China)

A bodipy-based fluorescence probe for thiols was developed with high sensitivity and excellent selectivity at a physiological pH(7.4) value.Its structure was characterized by nuclear magnetic resonance(NMR) and high resolution mass spectrometry(HRMS).This probe was designed based on the mechanism that thiols induced the Michael addition reaction to block photo-induced electron transfer process(PET) in this probe.The addition of thiols(0-1 000 μmol/L) to the solution of probe resulted in a remarkable fluorescence enhancement(150-fold) in the green spectra region.Meanwhile，probe was able to detect relatively low concentrations of thiols and the fluorescence detection limit for common amino acids containing thiols，Cys was determined to be 4.5×10-7mol/L.Additionally，similar results were obtained affording 1.2×10-7mol/L and 2.1×10-7mol/L detection limits for GSH and Hcy，respectively.The probe exhibited high selectivity and sensitivity towards thiols over other amino acids.Most importantly，the probe has been successfully utilized for thiols imaging in living cells，which makes it a good candidate for application in biological systems.

synthesis; application; fluorescence probe; determination; biothiols

2016-01-09；

2016-02-06

齊齊哈爾市科學技術計劃項目(SFGG-201416)

陳頌，博士，講師，研究方向：熒光探針的合成與應用，Tel：0452-2663881，E-mail：chensongchemistry@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.021

O657.3;O623.81

A

1004-4957(2016)08-1046-04