基于不同測序技術的生物群落結構及功能菌分析

蔡言安,李 冬,畢學軍,曾輝平,張 杰,3

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基于不同測序技術的生物群落結構及功能菌分析

蔡言安,李 冬2*,畢學軍1,曾輝平2,張 杰2,3

(1.青島理工大學環境與市政工程學院,山東 青島 266033；2.北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室,北京 100124；3.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090)

分別采用克隆文庫和高通量測序技術,解析生物去除鐵錳氨濾池內微生物的群落結構和功能菌多樣性,并探討不同測序手段的差異.高通量測序獲得15057條有效序列、共32個分類綱,克隆文庫測序涵蓋9個具有明確分類地位的綱(75條序列),前者能揭示更為豐富的細菌群落結構多樣性.功能菌(鐵錳氧化細菌和硝化細菌)分析過程中,一些功能菌屬在克隆文庫中出現,而在高通量測序中未檢測到,反之亦然.與單一的測序手段相比,二者相結合能更好地揭示功能細菌的分布特點.

生物濾池；硝化作用；高通量測序；克隆文庫

在生物水處理領域,生物反應器內的功能微生物是研究的熱點.分子生物學技術手段的應用,使研究者對生物反應器的運行效果、內在反應機理、微生物群落演替等有了深入地了解.

聚合酶鏈式擴增反應(PCR)是分子生物技術分析中至關重要的一步,其目的是采用引物擴增目標細菌的16S rRNA分子片段或功能基因片段,實現對微生物樣品中功能細菌的快速定性定量分析.分子片段特異引物可定向擴增某一菌屬內的細菌,而功能基因擴增引物卻能擴增生態功能相近、在親緣關系較遠的多個種屬內的細菌[1].例如,功能基因引物Amoa1F/Amoa2R可擴增好氧氨氧化菌AOB菌屬(、)的功能基因片段;NIT3r/338f可定向擴增的16S rRNA基因片段、Ntspa685r/338f定性擴增的16S rRNA基因片段[2-3].

對于鐵錳氧化細菌,采用16S rRNA分子片段特異性引物或功能基因擴增引物研究其結構多樣性均存在一定的困難.首先,所設計的16S rRNA分子片段擴增引物(PS-1/PSP-6)多針對于屬,無法同時分析其他的鐵錳氧化菌屬(包括以及等),并且該引物可非特異性擴增非屬的細菌[4].其次,多銅氧化酶基因()被認為是參與生物錳氧化的功能基因,但其擴增引物(CumAF/CumARdg)同樣存在非特異性擴增的缺陷[5].

因此,考慮到上述鐵錳氧化菌擴增引物存在的一系列問題,本文基于細菌通用引物,分別采用克隆文庫和高通量技術分析生物濾池內鐵錳氧化菌和硝化細菌群落結構多樣性,并對比探討了二者的各自分析特點.

1 材料方法

1.1 生物濾池反應器

生物濾池反應器由圓柱體有機玻璃制成,總高度3m、內徑185mm;石英砂為濾料、濾層高度130cm,重力流過濾、液上水頭保持30~40cm.生物濾池已成熟運行數年[6],本實驗過程中,模擬進水鐵、錳、氨氮濃度分別為1.5~2.5mg/L、0.6~ 0.8mg/L、1.0~1.2mg/L,生物濾池對污染物去除率均保持在95%以上.

1.2 基因組DNA提取

DNA提取過程:自生物濾層內取10g泥砂混合濾料,置于10mL滅菌離心管中,分別加入2.7mLDNA提取液、50μL蛋白酶K (Proteinase K,30g/L)、溶菌酶(lysozyme,20g/L);將離心管在37℃水浴振蕩器中震蕩30min、轉速22;隨后加入0.3mL濃度20%的SDS、水浴65℃、2h.

將上述離心管室溫冷卻后8000r/min離心10min,取上清液轉移至另一離心管、記錄體積;加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合、8000r/min離心10min;吸取上清液至另一離心管.繼續加入0.6倍體積的異丙醇,–20℃過夜后10000r/min離心5min;去上清液后繼續10000r/min、離心5min;再次盡量吸去上清液,將離心管內沉淀物置于通風櫥內晾干;最后,以300~500μLTE緩沖液溶解后,收集至1.5mL離心管保存.

瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的基因組DNA溶液,若DNA分子跑膠拖帶嚴重,則采用基因組純化試劑盒予以純化.

1.3 PCR擴增過程

以上述所得基因組DNA溶液為模板、1492R(5‘-TACCTTGTTAYGACTT-3’)和27F (5‘-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)為特異引物,進行PCR擴增.按照TaKaRa酶說明書配制PCR反應體系50μL,擴增采用降落式PCR程序:初始94℃變性5min、30個循環擴增:94 ℃變性45s、58℃退火45s(每個循環退火溫度降低0.1℃)、72℃延伸1min,72℃延伸7min.

擴增均設3次平行,所獲得PCR反應產物片段經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后合并于一只離心管內.采用純化試劑盒對PCR產物進行切膠回收后,再次采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段.最終的目的基因片段于4℃條件下保存,并于2d內完成后續克隆測序試驗.

1.4 克隆文庫構建

克隆采用的試劑盒與感受態細胞試劑盒均購自TaKaRa公司,按照操作說明書對上述所獲得的PCR產物進行克隆連接.克隆菌株經藍白斑后,選取陽性菌株過夜搖菌培養、菌液送至商業生物公司測序(生工,上海).

將測序序列采用軟件RDP classifier version 2.6進行分類地位劃分,相似度大于97%的序列被劃分為一個(OTU),同時與基因數據庫中序列比對分類地位最接近的菌株(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).Shannon指數通過EstimateS軟件計算獲得.

1.5 高通量測序

Illumina Miseq測序平臺測序通量高、快速經濟,其單個微生物樣品分析的商業成本與克隆文庫相當.高通量庫容通常可提供上萬條序列數,而克隆文庫的庫容卻含有數十條或數百條序列,高通量的單個序列成本遠低于克隆文庫.

高通量測序由商業服務公司完成(生工,上海).基于MiSeq測序平臺(美國Illumina公司),以所提取基因組DNA為模板,341F (5‘-CCTACG- GGNGGCWGCAG-3’)和805R (5‘-GACTACH- VGGGTATCTAATCC-3’)為引物,擴增細菌16S rRNA基因 V3-V4區序列.共獲得15057條有效序列,將相似度大于97%的序列劃分為一個OUT,采用mothur軟件(http://www.mothur.org/)計算Shannon指數并在線比對(http://www.arb- silva.de) 分類地位最接近的菌株.

2 結果與討論

2.1 生物群落結構對比分析

指標通常用以估算生物群落結構多樣性,其值高低代表群落結構多樣性的高低.克隆文庫分析過程中,通過EstimateS軟件分析得到的指標曲線相對比較平滑,表明序列條數已覆蓋樣品內的大部分微生物,其Shannon值為3.29;高通量分析過程中, Shannon曲線不再顯著變化時,其值為5.27.由Shannon值分析可知,采用高通量測序技術更能體現微生物群落結構的多樣性.

圖1(a)中,在綱的OTU分類水平上,克隆文庫中克隆子序列(75條)共覆蓋12個綱、其中9個綱有明確的分類地位:α變形綱(Alphaproteobacteria,30.7%)、β變形綱(Betaproteobacteria,16%)、γ變形綱(Gammaproteobacteria,13.3%)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira,12%)、δ變形綱(Deltaproteobacteri- a,5.3%)、黃桿菌綱(Flavobacteria,4%)、酸桿菌綱(Acidobacteria,4%)、豐佑菌綱(Opitutae,2.7%)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria,1.3%).

圖1(b)中,高通量所得序列(15057條)涵蓋32個綱,其中15個綱的序列均比例大于0.6%、占總綱的96.1%,可認為此15類綱是微生物的優勢類群.分析發現,這15個分類綱中包含了克隆文庫所獲得的9個分類綱;其中α變形綱占23.3%、β變形綱20.5%、γ變形綱6.2%、硝化螺旋菌綱20.2%、δ變形綱1.3%、黃桿菌綱1.2%、酸桿菌綱3.2%、豐佑菌綱0.9%、鞘脂桿菌綱12.4%,占總綱比例為89.2%,表明上述9類綱在15個主導綱中占有主體地位.因此,與克隆文庫技術相比,高通量技術在讀取序列方面具有信息量大的優點,使群落結構展現出更為豐富的多樣性、且Shannon值顯著提高,但克隆文庫所獲得的微生物群落結構同樣能體現出微生物群落的主體結構,盡管兩者的具體比例值有所不同.

生物濾池內的功能細菌,包括硝化細菌、鐵錳氧化細菌,是濾池發揮效能的關鍵因子.對比分析克隆文庫和高通量測序技術在解析微生物群落結構方面差異的同時,仍需探究不同分析方法對功能菌檢測的影響作用.

2.2 硝化細菌分析

硝化細菌包括好氧氨氧化細菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化細菌(NOB),是生物濾池內氨氮去除的功能細菌,表1統計了2種分析方法對AOB和NOB的檢測情況.

AOB常見的菌屬包括亞硝化單胞菌屬()和亞硝化螺旋菌屬(),二者均出現在克隆文庫內,在高通量分析庫中卻并未出現與亞硝化螺旋菌屬相關的細菌序列.Li等[7]同樣采用克隆文庫和T-RFLP技術手段分析了鐵錳氨凈化濾池內生物群落結構,并沒有檢測到AOB,且認為氨氮的氧化歸功于其他種類的微生物.一方面,本文試驗結果進一步證明了生物濾池內存在與氨氮氧化相關的AOB菌;另一方面,結果表明不同測序技術在功能菌分析方面存在差異.

表1 基于克隆文庫與高通量測序的硝化細菌分析Table 1 Analysis of nitrifiers in the processes of clone library and high throughout sequencing

分析NOB可知,硝化螺旋菌屬()在克隆文庫和高通量測序庫中均占有極高的比例,分別高達30.7%、20.2%,而常見的硝化菌屬()卻未檢測到.有研究表明這是由于不同類型反應器對菌群不同的優勢選擇造成的[8-9].此外,是一種新型的亞硝酸氧化菌屬[10],在高通量序列中有2.5%的序列劃分在此屬內;而克隆文庫中未檢測到此類菌群.

此外,克隆文庫分析過程中NOB序列數所占比例顯著高于AOB,二者比例分別為30.7%、5.3%;高通量分析過程中二者比例分別為22.7%、7.3%. 由于氨氧化古菌(AOA)亦能將氨氮氧化為亞硝酸鹽氮[11], AOA可能存在于生物濾池內, 而本研究中未對AOA予以分析.因此,今后研究AOB、AOA、NOB三者的相對比例能更好的體現參與硝化過程的功能微生物.

2.3鐵錳氧化菌分析

中性pH值水體條件下,鐵在濾層內以化學溶解氧接觸氧化去除為主,而錳僅可由生物氧化作用去除,表2統計了與鐵錳氧化相關的菌群.

嘉利翁氏菌屬()是一類鐵氧化相關的菌,僅能氧化鐵離子.鐵極易被溶解氧化學接觸氧化,有研究發現高達94%以上的鐵是通過化學途徑去除[12],但克隆文庫中檢測到嘉利翁氏菌屬,表明生物氧化作用不可忽視,與Michalakos等[13]的反應器運行數據表現一致;但該類菌的序列在高通量序列中未檢測到.

表2 基于克隆文庫與高通量測序的鐵錳細菌分析Table 2 Analysis of Fe- and Mn-related bacteria in the processes of clone library and high throughout sequencing

泉發菌屬()、纖發菌屬()與生絲微菌屬()是常見的錳氧化菌屬,三者同時出現在高通量序列中,而僅有泉發菌屬出現克隆文庫中.Hope等[14]認為纖發菌屬是反應器內錳氧化的主體優勢菌屬,但Burger等[15]基于四座實際規模生物濾池分析了錳氧化細菌,認為錳的去除與纖發菌屬的存在沒有直接聯系、其他菌屬亦可完成錳的去除,這與本文高通量測序結果相一致,即泉發菌屬、纖發菌屬、生絲微菌屬共同參與了錳氧化過程.

另外,一些與鞘氨醇單胞菌屬()、黃桿菌屬()、紫色桿菌屬()、不動桿菌屬()相關的細菌被發現具有錳氧化能力,并且這些細菌多被發現在錳沉積物或錳礦環境中[16-17],在凈水領域中鮮有報道.與這些菌屬相關的細菌均出現在克隆文庫中,而僅有黃桿菌出現在高通量序列中.

總體而言,在功能菌分析過程中,一些菌屬在克隆文庫中出現,而在高通量測序中未出現,反之亦然.分析其原因,這兩種測序技術不能完全將其表達;其次,由PCR擴增過程的隨機性和擴增效率不同造成的.因而,采用克隆文庫和高通量測序相結合的技術手段可以相互彌補、更全面的解析功能菌的多樣性.

3 結論

3.1 與克隆文庫技術相比,高通量技術測序數量大、微生物分類豐富,更能體現微生物群落結構多樣性,但前者仍能體現微生物的優勢群落結構.單一的技術手段在解析功能細菌(硝化細菌和鐵錳氧化細菌)方面存在差異,克隆文庫與高通量技術相結合可更全面了解功能細菌的分布.

3.2 亞硝化單胞菌與亞硝化螺旋菌參與了氨氮氧化,硝化螺旋菌屬與新型的硝化菌屬參與了亞硝酸鹽的氧化.一些在凈水領域鮮有報道的鐵錳氧化菌屬,如鞘氨醇單胞菌屬、黃桿菌屬、紫色桿菌屬、不動桿菌屬等在本研究中均被檢測到.

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* 責任作者, 教授, cya_yanan@163.com

Analysis of microbial community structure and functional bacteria in a biofilter with different sequencing technologies

CAI Yan-an1, LI Dong2*, BI Xue-jun1, ZENG Hui-ping2, ZHANG Jie2,3

(1.School of Environmental and Municipal Engineering, Qingdao University of Technology, Qingdao 266033, China；2.Key Laboratory of Beijing Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；3.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)., 2016,36(6)：1830~1834

Effects of the technologies of clone library and high throughout sequencing for revealing microbial community structure and functional bacteria in a biofilter which simultaneously removes iron, manganese and ammonia were compared. 15057 sequences with 32 classifications in class level were obtained after the high throughout sequencing process, while there are 9classified groups in clone library. The former revealed more diversity of bacterial community structure. However, in the functional bacteria analysis process, some nitrifiers or iron and manganese bacteria which were detectable in one sequencing analysis process were not appeared in the other process. Comparing with using these two technologies individually in the analysing process, the combined using can compensate for each other and reveal the functional bacteria better.

biofilter；nitrification；high throughout sequencing；clone library profiling

X522

A

1000-6923(2016)06-1830-05

蔡言安(1986-),男,山東高密人,講師,博士,主要從事水污染控制與水質保障技術研究.發表論文13篇.

2015-11-28

國家自然科學基金優秀青年科學基金(51222807)