雙孢蘑菇液體菌種應用研究初探*

曾志恒，曾輝,2，程翊，楊雷，謝神斌，戴建清

（1. 福建省農業科學院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建 福州 350014；2. 吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130018）

雙孢蘑菇液體菌種應用研究初探*

曾志恒1，曾輝1,2，程翊1，楊雷1，謝神斌1，戴建清1

（1. 福建省農業科學院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建 福州 350014；2. 吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130018）

對雙孢蘑菇新菌株W38液體菌種在栽培種生產中的應用做了初步研究。液體菌種為原種轉接固體培養基培養，以固體菌種為對照，進行對比試驗，結果表明：液體菌種在PDA上的菌絲生長速度與固體菌種的差異不顯著(P＞0.05)；在麥粒培養基中的菌絲生長速度與固體菌種的差異不顯著(P＞0.05)，但滿袋時間短于固體菌種，兩者的差異極其顯著(P＜0.01)。在實驗室條件下，以液體菌種為原種擴繁袋裝麥粒栽培種的接種量為10mL，菌絲萌發率達100%；采用恒流泵接種方式接種效率最高，達到300袋·h-1；栽培種的成品率達到98%，比固體菌種為原種擴繁栽培種的成品率96%高，但兩者的差異不顯著(P＞0.05)；液體菌種擴繁栽培種的平均單產14.52kg·m-2，較固體菌種擴繁栽培種的平均單產14.49kg·m-2高，兩者的差異不顯著(P＞0.05)。雙孢蘑菇液體菌種在栽培種生產上具有良好的應用前景。

雙孢蘑菇；液體菌種；生產應用

食用菌液體菌種以其具有培養時間短、發菌快、菌齡整齊一致、接種方便等優點，并有利于規模化、工廠化生產，越來越受到科研單位、生產企業的青睞，已成為食用菌制種的發展趨勢［1］。當前，我國雙孢蘑菇制種工藝主要采用固體菌種逐級擴繁生產母種、原種和栽培種［2］。隨著食用菌工廠化生產的發展，越來越多生產企業采用液體菌種進行食用菌生產，并在金針菇、杏鮑菇等食用菌工廠化生產中取得成功［3-4］。對雙孢蘑菇液體菌種的研究多數是集中在發酵工藝的報道［5］，對液體菌種的應用研究也只見韓文清等［6］的再固化應用研究。文章以雙孢蘑菇液體菌種為原種擴繁栽培種，以固體菌種為對照，對菌種活力、萌發率、菌絲走菌速度、接種方式及出菇試驗進行對比研究，以期為雙孢蘑菇液體菌種在栽培種生產中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

雙孢蘑菇新菌株W38，由福建省農業科學院食用菌研究所提供。

1.2 液體培養基配方

1.2.1 搖瓶種子培養基

馬鈴薯100g. L-1，麩皮50g. L-1，紅糖10g. L-1，蛋白胨2g . L-1， MgSO4·7H2O 0.75 g . L-1，KH2PO4 2.0 g . L-1, VB110 mg . L-1。

1.2.2 液體菌種培養基

小米粉49.90 g . L-1，黃豆粉13.60 g . L-1，KH2PO4 2.00 g . L-1，MgSO4·7H2O 1.0675 g . L-1，pH 6.5。

1.3 固體培養基配方

1.3.1 麥粒菌種培養基

小麥 98%，石膏粉 2%，含水量45%±1%，pH 7.5-8.0。

1.4 實驗儀器

電子分析天平、SW-CJ-2F潔凈工作臺、BSDYX2200恒溫搖床、SPX-250B-Z生化培養箱和BF400H/YZ25Ⅱ恒流泵

1.5 試驗方法

1.5.1 菌種活化

在無菌操作條件下，從保藏的斜面雙孢蘑菇菌種中，切出0.2cm×0.5cm大小的菌塊接種于PDA斜面，在生化培養箱中24 ℃培養20d。

1.5.2 搖瓶種子的培養

將活化雙孢蘑菇菌株試管母種切割成0.5cm×0.5cm大小的菌塊，轉接到250mL三角瓶中的100mL滅菌搖瓶種子培養基上，每瓶三角瓶接4塊菌塊，靜置培養2d后，在培養溫度24℃、搖瓶轉數180r.min-1的恒溫搖床中旋轉振蕩培養10d，得到雙孢蘑菇搖瓶種子。

1.5.3 液體菌種的培養

在無菌操作條件下，將雙孢蘑菇搖瓶種子用組織搗碎機勻漿。250mL三角瓶裝入液體原種培養基100mL，滅菌后接入5 % (V/V)搖瓶種子，在培養溫度24 ℃、搖瓶轉數180 r . min-1的恒溫搖床中旋轉振蕩培養7d，獲得雙孢蘑菇W38液體菌種。

1.5.4 勻漿液體菌種的制備

在潔凈工作臺中，將雙孢蘑菇液體菌種用組織搗碎機，刀軸在轉數5000 r . min-1條件下搗碎1min，獲得勻漿雙孢蘑菇液體菌種。

1.6 分析方法

1.6.1 液體菌種活力測定

用接種針從液體菌種中挑取1粒菌絲球置于PDA平皿中央，每組10個平皿，重復3次，以麥粒原種為對照。接種后放入生化培養箱中25℃培養，觀察菌絲萌發情況，記錄萌發時間，培養5d后，在菌絲邊緣畫一起始線，繼續培養10d，再在菌絲邊緣畫一終止線，測量菌絲生長長度，計算菌絲生長速度。

1.6.2 菌絲生長速度測定

當雙孢蘑菇菌絲生長至1～2 cm時，在袋口端邊緣畫一起始線，待生長最快的菌絲即將長滿菌種袋時再畫一終止線，測量菌絲生長長度，計算菌絲生長速度。

1.6.3 液體菌種在固體培養基中的走菌實驗

將500g麥粒基質基裝入15cm×30cm折角聚丙烯菌種袋中，經126℃、2.5h高溫高壓滅菌，冷卻后在超凈工作臺中接入10mL雙孢蘑菇液體菌種，以麥粒菌種作為對照。接種后，置于培養室25℃培養，觀察菌絲萌發、走菌情況，并計算栽培種成品率。

1.6.4 出菇試驗

出菇試驗的栽培方法參照文獻[7]。

2 結果與分析

2.1 菌種活力的比較

將雙孢蘑菇液體菌種和麥粒菌種轉接PDA平皿中培養，對這2種類型的菌種活力進行比較，實驗結果如表1 所示，液體菌種的菌絲萌發時間為36h，較麥粒菌種的24h長；它們在PDA平皿中發萌發率都為100%；液體菌種在PDA平皿的菌絲生長速度為4.35mm·d-1，較麥粒菌種的4.49mm·d-1慢，但兩者的菌絲生長速度的差異不顯著(P＜0.05)。

表1 液體菌種與麥粒菌種的活力比較

表2 液體菌種與固體菌種在麥粒培養基中的走菌情況

2.2 液體菌種在麥粒培養基中的走菌情況

向袋裝麥粒培養基中接入10mL雙孢蘑菇液體菌種，以麥粒菌種為對照，對應的菌種每組10袋，設3個重復，觀察菌種在麥粒培養基中的走菌情況，測量菌絲生長長度，計算菌絲生長速度，記錄滿袋時間。由表2可知，液體菌種在麥粒培養基中的菌絲生長速度低于麥粒菌種，其中液體菌種的菌絲生長速度為3.51mm·d-1，麥粒菌種的菌絲生長速度3.53mm·d-1，但兩者的差異不顯著(P＞0.05)，這說明液體菌種在麥粒培養基的走菌速度與麥粒菌種相當。但液體菌種在麥粒培養基中的滿袋時間短于麥粒菌種，兩者的差異極其顯著(P＜0.01)，這是由于液體菌種萌發點多且具有流動性所導致的。勻漿液體菌種沒有在麥粒培養基中萌發，說明液體菌種經組織搗碎后得到勻漿液體菌種不適合在麥粒培養基中生長。

2.3 接種量的確立

在袋裝麥粒基質中，不同的接種量對菌絲萌發的影響見表3，每個處理組20袋，重復3次，記錄菌絲萌發情況，計算萌發率。由表3可知，隨著接種量的增加，萌發率也逐步增大，當接種量達到10mL時，萌發率為100%。由此確定以液體菌種為種源的袋裝栽培種（500g麥粒培養基）的接種量為10mL。

2.4 液體菌種為種源的栽培種成品率測定

以液體菌種作為原種，將10 mL雙孢蘑菇液體菌種接入袋裝麥粒培養基中，以麥粒菌種為對照組，每個處理組100袋，重復3次。在潔凈工作臺中分別將液體菌種和麥粒菌種接入麥粒培養基中，爾后置于培養架，在培養室25℃恒溫培養，記錄染菌情況，計算栽培種成品率。結果表明（表4所示），雙孢蘑菇液體菌種接入麥粒培養基中，經培養，栽培種平均成品率能達到98%，優于麥粒菌種為種源的栽培種平均成品率96%，但兩者的差異不顯著(P＞0.05)。

表3 不同接種量對菌絲萌發的影響

表4 液體菌種與固體菌種制作栽培種成品率對比

2.5 接種方式的比較

在實驗室條件下，液體菌種采用恒流泵和移液槍2種接種方式轉接袋裝麥粒培養基，以麥粒菌種采用傳統的接種勺接種方式為對照，每組50袋，重復3次，記錄接種所需時間，計算比較3種接種方式的接種效率。如表5所示，50袋菌袋采用恒流泵的接種方式所需接種時間為10 min，接種效率為300袋·h-1；采用移液槍的接種方式所需接種時間為12.5 min，接種效率為240袋·h-1；采用接種勺的接種方式所需接種時間為15min，接種效率為200袋·h-1。因此，采用恒流泵的接種方式所需接種時間最短，接種效率最高。

表5 不同接種方式的比較

2.6 液體菌種為種源的栽培種出菇表現

以液體菌種為種源的麥粒栽培種在培養料中萌發時間24h，與以麥粒菌種為種源的麥粒栽培種對照組相同，兩者菌絲濃白，菌絲吃料、爬土時間都與對照組沒有明顯差異（見表6、圖 1），但以液體菌種作為種源栽培種平均單產為14.52kg·m-2，略高于麥粒菌種為種源的麥粒栽培種平均單產14.49kg·m-2。但通過統計分析，它們的單產差異不顯著(P＞0.05)。

表6 菌絲萌發吃料、爬土及出菇產量情況

3 討論

從菌種活力比較試驗結果中，我們可知液體菌種在PDA上的萌發時間比固體菌種長12 h，這可能由于菌種從液體轉到固體培養，菌絲生長需要時間適應新的培養條件所造成的；它們具有相同的100%萌發率，菌絲生長速度差異不顯著(P＞0.05)，說明它們的菌種活力相當。液體菌種在麥粒培養基中的菌絲生長速度低于固體菌種，但兩者的差異不顯著(P＞0.05)，但液體菌種在麥粒培養基中的袋時間短于固體菌種，兩者的差異極其顯著(P＜0.01)，這是由于液體菌種萌發點多且具有流動性所造成的。勻漿液體菌種沒有在麥粒培養基中萌發生長，雖然菌絲球經勻漿后，萌發點增多，但直徑較小的菌球或菌絲片段不適合在麥粒培養基中生長，這為今后的發酵罐的選型及液體菌種菌絲球大小要求提供參考依據。

在確立麥粒培養基接種量試驗中，隨著接種量的增大，會導致培養基含水量的增大，從而造成袋裝底端的栽培種容易結塊，播種時容易損傷菌種菌絲。因此，確立接種量為10mL較為適宜，含水量能控制在43%-45%范圍內。在實驗室條件下，液體菌種采用恒流泵接種方式轉接袋裝麥粒培養基所需接種時間最短，接種效率最高，是采用傳統的接種勺接種效率1.5倍，因其具有流動性，可計量性，便于接種工藝的機械化、自動化應用。在出菇試驗中，以液體菌種為原種擴繁的栽培種平均單產達14.52kg·m-2，與固體菌種為原種擴繁的栽培種單產差異不顯著(P＞0.05)，這與韓文清等[6]得出試驗結果類似。

研究采用的雙孢蘑菇W38液體菌種是通過搖瓶發酵培養所獲得的，還有待完善液體菌種發酵罐深層發酵培養工藝的技術參數。以液體菌種為原種擴繁栽培種，以固體菌種為對照，對雙孢蘑菇液體菌種在栽培種生產中的應用做了初步研究，為證實液體菌種在雙孢蘑菇制種工藝的應用具有優越性提供了科學依據。

[1] 戴建清，曾志恒.食用菌液體菌種研究現狀及發展趨勢[J]. 中國食用菌，2012，5: 1-3.

[2] WANG ZS. Progress on the breeding, spawn-making and year-round cultivation of Agaricus bisporus in Fujian, China[J].Acta Edulis Fungi, 2005, 12(Suppl. ): 236-242.

[3] 張鵬, 許占伍, 倪小軍, 等. 金針菇工廠化生產液體菌種培養基的配方研究[J]. 食藥用菌, 2012, 5: 296-297.

[4] 沈敏, 李文生, 周磊. 杏鮑菇液體菌種研制與工廠化栽培應用[J]. 中國農技推廣, 2011, 27(6): 14-15.

[5] 黃愛榮，繆禮鴻，邊銀丙. 雙孢蘑菇液體菌種發酵工藝研究[J]. 食用菌，2009（5）：12-13

[6] 韓文清，張銳，趙德勝. 雙孢蘑菇液體菌種再固化應用研究[J]. 食用菌，2014（2）：40-41

[7] 王澤生，王波，盧政輝. 圖說雙孢蘑菇栽培關鍵技術[M]. 北京：中國農業出版社，2010:1-72.

S646

A

1007-550X（2016）09-0030-05

10.3969/j.issn.1007-550X.2016.09.001

福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項（2014R1020-3）、（2015R1020-2）；國家農業科技成果轉化項目[閩財指（2014）969號]

2016-08-15

曾志恒(1984-)，男，碩士，主要從事食用菌制種工藝研究。

戴建清(1972-)，男，高級工程師，主要從事食用菌制種工藝研究（E-mail:djq1972@gmail.com）。