丹參多酚酸鹽對過氧化氫所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響*

李兵

（邯鄲市中心醫院急診科，邯鄲　056001）

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丹參多酚酸鹽對過氧化氫所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響*

李兵

（邯鄲市中心醫院急診科，邯鄲056001）

［目的］研究丹參多酚酸鹽（Salvianolate）對過氧化氫（H2O2）所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。［方法］于無菌環境下分離并培養乳鼠心肌細胞72 h后隨機分為空白對照組、H2O2組、丹參多酚酸鹽（50、100和200 mg/L）+H2O2組，每組設8個復孔；給藥干預24 h后，檢測培養液中谷草轉氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）含量，四甲基噻唑藍（MTT）法檢測細胞存活率，通過流氏細胞術（Flow Cytometry）檢測細胞凋亡狀況并計算凋亡率；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測AKT mRNA和bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達并計算bcl-2/Bax表達比值，Western blotting法檢測細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、核轉錄因子-κB（NF-κB）表達并進行半定量分析，測定細胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。［結果］與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽（100、200 mg/L）+H2O2組培養液中AST、CPK、LDH含量顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低。細胞中細胞中AKT mRNA、bcl-2 mRNA表達顯著上調，Bax mRNA表達顯著下調，bcl-2/Bax表達比值顯著升高，caspase-3、NF-κB表達顯著下調，SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，上述差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。［結論］丹參多酚酸鹽對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡具有抑制作用。

丹參多酚酸鹽；過氧化氫；心肌細胞；凋亡；影響

近年來，冠心病及其所引發的急性心肌梗死已經逐漸發展成為嚴重危害人類生命健康的主要疾病，目前臨床上主要采取溶栓、介入手術等方法及時恢復血流供應，極大降低了心肌梗死患者的死亡率，但“再灌注損傷”并發癥的存在嚴重影響著該類患者的愈后，史婷婷等［1］和劉艷霞等［2］均研究發現繼發性心肌細胞凋亡是其重要的病理基礎，丹參多酚酸是中藥丹參的主要活性成分之一，能夠通過改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷以及抑制神經細胞凋亡而對腦缺血再灌注損傷大鼠起到保護作用［3］；但丹參多酚酸是否對心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡具有抑制作用尚未見文獻報道。本實驗通過過氧化氫（H2O2）誘導制備乳鼠心肌細胞損傷模型，研究丹參多酚酸鹽對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響及其作用機制。

1　材料和方法

1.1藥物與試劑丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，規格：每瓶50 mg，批號：150307）；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；甲基四唑藍（MTT）購自美國Sigma公司；谷草轉氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；AnnexinVFITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海時代生物科技有限公司；AKT、bcl-2、Bax上下游引物購自上海博亞生物公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、核轉錄因子-κB（NF-κB）單克隆抗體購自碧云天生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2動物清潔級雄性SD大鼠1～3 d乳鼠［4］，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。

1.3主要儀器VD-650-U型超凈工作臺（上海楚度儀器設備有限公司）；MCO-175型CO2培養箱（日本三洋集團）；UV-1800 PC型紫外-可見分光光度計（廣州科曉科學儀器有限公司）；BS-300型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；Model-680型酶標儀（美國BIO-RAD公司）；FACS Aria型流式細胞儀（美國BD公司）；DYY-11型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽（北京六一儀器廠）；RT-PCR儀（武漢新未來儀器技術有限公司）。

1.4細胞的分離與培養參照李澎等［4］報道的實驗方法分離和培養乳鼠心肌細胞，培養72 h后，將狀態良好的原代乳鼠心肌細胞隨機分為：空白對照組、H2O2組、丹參多酚酸鹽（50、100和200 mg/L）+ H2O2組，每組設8個復孔。經藥物干預24 h后，檢測細胞及其培養液中各指標。

1.5培養液中AST、CPK、LDH含量的測定經藥物干預24 h后，分別取各組細胞培養液并按照各試劑盒操作方法進行處理，然后通過全自動生化分析儀平行測定各組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量。

1.6細胞存活率的檢測將細胞接種于96孔培養板（n=6），每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h后棄上清清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩15 min后，通過酶標儀檢測490 nm處OD值，計算細胞存活率：

細胞存活率（%）=（實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%

1.7細胞凋亡狀況檢測及凋亡率計算經0.25%的胰酶消化后離心棄上清液，應用PBS溶液將沖洗2次后，按照細胞凋亡檢測試劑盒操作方法步驟依次進行處理后通過Flow Cytometry檢測，觀察各組細胞凋亡狀況并在流式二維圖中計算凋亡率。

1.8細胞中AKT mRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表達的檢測及bcl-2/Bax比值的計算1）查閱大鼠AKT、bcl-2、Bax、β-actin基因cDNA序列并通過Oligo軟件設計上、下游引物，見表1。2）常規消化后收集各組細胞，加入適量Trizol試劑提取總RNA并測定總RNA濃度，取1μg RNA反轉錄為cDNA，然后進行PCR反應，擴增完畢后，取PCR產物于瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并照相。3）以βactin為內參，由灰度值進行半定量分析AKTmRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表達，并計算bcl-2/Bax表達比值。

1.9細胞中caspase-3、NF-κB蛋白表達的檢測

取細胞并通過超聲波細胞破碎儀冰浴中破碎后，經12 000 r/min低溫離心 10 min后取沉淀，經BCA法蛋白定量后，行變性、上樣，經電泳、轉膜、春紅溶液染色后，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（caspase-3，NF-κB，β-actin）4℃過夜。洗膜，二抗室溫搖床上孵育1 h后經ECL顯色，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

表1　大鼠AKT、bcl-2、Bax、β-actin基因上、下游引物序列及擴征片段長度Tab.1　The upstream and downstream primer sequences and amplified fragment length of AKT，bcl-2，Bax and β-actin in rats

1.10細胞中SOD、CAT活性和MDA含量的測定取1.9所制備的細胞裂解液，經低溫離心取上清液，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組細胞裂解液中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.11統計學方法運用軟件SPSS 18.0進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間均數比較采用單因素方差進行分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett't T3法，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1丹參多酚酸鹽對H2O2損傷乳鼠心肌細胞培養液中AST、CPK、LDH含量的影響H2O2組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量較空白對照組顯著升高（P＜0.01）。與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽（100、200 mg/L）+H2O2組AST、CPK、LDH含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結果見表2。

表2　各組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量（±s）Tab.2　The contents of AST，CPK，LDH in culture medium of cells of each group（±s）

表2　各組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量（±s）Tab.2　The contents of AST，CPK，LDH in culture medium of cells of each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與H2O2組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

LDH （U/L）空白對照組　8 20.9±4.1　1.38±0.35　530.8±61.7 H2O2組　8 34.2±6.5*2.64±0.55*914.5±102.4*組別　孔數AST （U/mL）CPK （U/mL）丹參多酚酸鹽（50 mg/L）+H2O2組　8 30.9±7.0　2.41±0.63　868.7±110.5丹參多酚酸鹽（100 mg/L）+H2O2組　8 26.4±5.3#1.97±0.48##776.1±85.4#丹參多酚酸鹽（200 mg/L）+H2O2組　8 23.1±5.6##1.62±0.39##652.7±70.9##

2.2丹參多酚酸鹽對H2O2損傷乳鼠心肌細胞存活率的影響H2O2組乳鼠心肌細胞存活率較空白對照組顯著降低（P＜0.01）。與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽（100、200 mg/L）+H2O2組細胞存活率顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），結果見表3。

表3　各組細胞存活率和凋亡率（±s）Tab.3　The cardiomyocytes survival rate and apoptosis of cells in each group（±s）

表3　各組細胞存活率和凋亡率（±s）Tab.3　The cardiomyocytes survival rate and apoptosis of cells in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與H2O2組比較，#P＜0.01。

凋亡率（%）空白對照組　8　97.1±4.2　4.5±1.8 H2O2組　8　46.8±5.6*　53.6±6.2*丹參多酚酸鹽（50 mg/L）+H2O2組　8　49.3±6.8　46.2±6.9丹參多酚酸鹽（100 mg/L）+H2O2組　8　67.5±9.4#　37.0±5.4#丹參多酚酸鹽（200 mg/L）+H2O2組　8　80.7±12.3#　18.2±3.6#組別　孔數存活率（%）

2.3丹參多酚酸鹽對H2O2損傷乳鼠心肌細胞凋亡狀況的影響H2O2組細胞凋亡數量較空白對照組明顯增多；而經丹參多酚酸鹽干預24 h后，能夠顯著改善H2O2損傷乳鼠心肌細胞凋亡狀況，以丹參多酚酸鹽（200 mg/L）+H2O2組效果最為顯著，見圖1。H2O2組細胞凋亡率較空白對照組顯著增高（P＜0.01）；與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽（100、200 mg/L）+ H2O2組凋亡率顯著降低（P＜0.01），結果見表3。

2.4丹參多酚酸鹽對H2O2損傷乳鼠心肌細胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及bcl-2/Bax比值的影響H2O2組細胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達較空白對照組均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01）；與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽（100、200 mg/L）+H2O2組AKT mRNA、bcl-2 mRNA表達顯著升高而Bax mRNA表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.01），結果見表4。

2.5丹參多酚酸鹽對H2O2損傷乳鼠心肌細胞NF-κB、caspase-3蛋白表達的影響H2O2組乳鼠心肌細胞中NF-κB、caspase-3蛋白表達量顯著增高（P＜0.01）。與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽（100、200 mg/L）+ H2O2組NF-κB、caspase-3蛋白表達量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結果見圖2和表5。

表4　各組細胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及bcl-2/Bax比值（±s）Tab.4　The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA，Bax mRNA and the ratio of bcl-2/Bax of cells in each group（±s）

表4　各組細胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及bcl-2/Bax比值（±s）Tab.4　The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA，Bax mRNA and the ratio of bcl-2/Bax of cells in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與H2O2組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　孔數　AKT（×10-3）　bcl-2（×10-3）　Bax（×10-3）　bcl-2/Bax空白對照組　8　1.58±0.37　32.9±5.8　63.2±15.0　0.52±0.20 H2O2組　8　1.99±0.52*　44.2±7.6*　109.7±24.3**　0.39±0.18**丹參多酚酸鹽（50 mg/L）+H2O2組　8　2.17±0.68　48.1±9.3　100.5±26.8　0.48±0.25丹參多酚酸鹽（100 mg/L）+H2O2組　8　2.60±0.81#　56.0±10.4#　91.7±23.4#　0.61±0.24#丹參多酚酸鹽（200 mg/L）+H2O2組　8　2.93±0.85##　64.7±11.2##　76.9±18.2##　0.85±0.37##

圖1　各組細胞凋亡狀況Fig.1　The cardiomyocytes apoptosis of cells in each group

圖2　各組細胞NF-κB、caspase-3蛋白表達Fig.2　The expression of NF-κB，caspase-3 protein of cells in each group

表5　各組細胞NF-κB、caspase-3蛋白表達（±s）Tab.5　The expression of NF-κB，caspase-3 protein of cells in each group（±s）

表5　各組細胞NF-κB、caspase-3蛋白表達（±s）Tab.5　The expression of NF-κB，caspase-3 protein of cells in each group（±s）

注：與空白對照組比較：*P＜0.01；與H2O2組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　孔數　NF-κB/ β-actin caspase-3/ β-actin空白對照組　8　0.17±0.06　0.18±0.05 H2O2組　8　0.45±0.12*0.63±0.12*丹參多酚酸鹽（50 mg/L）+H2O2組　8　0.37±0.11　0.52±0.16丹參多酚酸鹽（100 mg/L）+H2O2組　8　0.32±0.07#0.37±0.10##丹參多酚酸鹽（200 mg/L）+H2O2組　8　0.25±0.07##0.29±0.11##

2.6丹參多酚酸鹽對H2O2損傷乳鼠心肌細胞中SOD、CAT活性和MDA含量的影響H2O2組乳鼠心肌細胞SOD、CAT活性較空白對照組顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽（100、200 mg/L）+H2O2組SOD、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），結果見表6。

表6　各組細胞中SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.6　The activity of SOD，CAT and the contents of MDA of cells in each group（±s）

表6　各組細胞中SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.6　The activity of SOD，CAT and the contents of MDA of cells in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與H2O2組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

MDA （nmol/mg prot）空白對照組　8　114.5±13.7　32.3±7.0　7.1±1.6 H2O2組　8　62.2±10.8*　17.6±4.5*　12.9±1.9*丹參多酚酸鹽（50 mg/L）+H2O2組　8　71.3±12.5　22.1±5.7　11.3±2.4丹參多酚酸鹽（100 mg/L）+H2O2組8　84.9±14.0#　25.9±6.3##　7.5±1.6##丹參多酚酸鹽（200 mg/L）+H2O2組8　95.7±18.1##29.0±7.1##　6.8±1.8##組別　孔數SOD （U/mg prot）CAT （U/mg prot）

3　討論

缺血再灌注損傷的病理機制非常復雜，其中細胞凋亡在其發生發展過程中發揮著重要作用。細胞凋亡是一種由多種基因參與調控的程序化死亡過程，其中AKT為抗凋亡基因，在細胞凋亡過程中發揮著重要的調控作用［5］。bcl-2為抑凋亡基因、Bax為促凋亡基因，它們都屬于bcl-2基因家族，兩者間相互作用、共同調控細胞凋亡過程［6］。并且Jayanthi S等［7］進一步研究發現，bcl-2和Bax對細胞凋亡的調控更依賴于bcl-2/Bax表達比值，bcl-2/Bax比值越低，往往凋亡狀況越嚴重。Caspases蛋白家族參與細胞凋亡啟動以及整個過程的調節，其中caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵蛋白酶［8］。

細胞凋亡是一種繼發行為，氧化應激損傷是其最重要的誘發因素之一［9-10］。正常生理狀態下，體內生成的氧自由基在SOD和CAT的依次催化作用下最終還原生成對人無害的H2O和O2［11-12］，因此SOD、CAT的活性能夠直接反應機體抗氧化能力；而血清中脂質過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映細胞損傷程度。正常生理狀態下，血清中心肌酶含量非常低，而當細胞膜受氧自由基攻擊而受損后將導致細胞中心肌酶迅速釋放入血，導致血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，因此血清中3者的活性水平能夠敏感地反映心肌細胞受損程度，它們也是臨床上監測心功能的常用指標。NF-κB為多效能核轉錄因子，被稱為連接氧化應激損傷和細胞凋亡的“橋梁”［13］。生理狀態下，NF-κB以無活性形式存在于胞質中，而當細胞受到ROS攻擊時，NF-κB將被活化并暴露出核定位信號而進入胞核內，Angkeow P等［10］和Deshpande SS等［14］研究發現，氧化應激或氧自由基可直接或間接激活NF-κB；Zhang Q等［15］研究發現，活化NF-κB能夠促進巨噬細胞活化和浸潤，誘導促凋亡信號釋放而導致細胞凋亡，證實NF-κB激活與氧化應激誘導的心肌細胞凋亡密切相關。

本實驗通過過氧化氫誘導損傷乳鼠心肌細胞進行體外研究發現：與H2O2組比較，經丹參多酚酸鹽干預24 h能夠有效提高H2O2誘導損傷乳鼠心肌細胞存活率、降低細胞凋亡率、改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷、上調抗凋亡基因AKT和bcl-2表達、下調促凋亡基因Bax基因表達、提高bcl-2/ Bax表達比值、降低caspase-3和NF-κB蛋白表達；提示丹參多酚酸鹽對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡具有抑制作用，作用機制可能與其能夠有效抑制氧化應激損傷、下調NF-κB蛋白表達以及調節凋亡相關基因和蛋白表達有關。

［1］史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27（5）：666-671.

［2］劉艷霞，顧云，辛毅，等.大鼠急性心肌缺血再灌注損傷誘導細胞凋亡的實驗研究［J］.心肺血管病雜志，2009；28（3）：191-194.

［3］王強，張一，李璐，等.丹參多酚酸鹽對大鼠腦缺血再灌注過氧化損傷的保護作用［J］.右江醫學，2010，38（6）：665-667.

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［5］葉強，陳良海，劉應才，等.辛伐他汀通過Akt/GSK3β通路抑制心肌梗死后心肌細胞凋亡［J］.中國藥理學通報，2011，27（12）：1656-1660.

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（本文編輯：高杉，馬英）

Effects of Salvianolate on neonatal rat cadiocytes apoptosis induced by H2O2

LI Bing
（Department of Emergency，Handan Central Hospital，Handan 056001，China）

［Objective］To investigate the effects of Salvianolate on neonatal rat cadiocytes apoptosis induced by H2O2.［Methods］Cadiocytes of neonate rat was cultivated for 72 hours and divided into six groups：normal control group，H2O2group，Salvianolate（50，100，200 mg/L）+H2O2groups（n=8）.The 12 hours after the drugs were given.The content of AST，CPK，LDH in culture medium were detected；the survival rate was detected by MTT；the cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated；the expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA，Bax mRNA were detected by RT-PCR and the ratio of bcl-2/Bax was calculated；the expression of caspase-3，NF-κB protein was detected by Western blot and Semi-quantitative analysized；the activity of SOD，CAT and the content of MDA in cardiomyocytes were determinted.［Results］Compared with the H2O2group，the content of AST，CPK，LDH in culture medium of Salvianolate（100，200 mg/L）+H2O2groups were significantly decreased；the survival rate were significantly increased；the cardiomyocytes apoptosis were improved and the apoptosis rate were significantly decreased；the expression of AKT，bcl-2 mRNA were significantly up-regulated，while the expression of Bax mRNA was significantly down-regulated，the ratio of bcl-2/Bax were significantly increased；the expression of caspase-3，NF-κB protein were significantly down-regulated；the activity of SOD，CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased，all of the difference above were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.［Conclusion］Salvianolate had inhibitive effects on neonatal rat cadiocytes apoptosis induced by H2O2.

Salvianolate；H2O2；cardiomyocyte；apoptosis；effect

R285.5

A

1672-1519（2016）08-0491-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.08.12

2016-04-28）

河北省衛生廳重點科技研究計劃（20130359）。作者簡介：李兵（1978-），男，主治醫師，研究方向為急診科疾病。