黃精發酵工藝的初步研究

楊婧娟，張希，譚書宇，趙聲蘭

（云南中醫學院，云南昆明650500）

黃精發酵工藝的初步研究

楊婧娟，張希，譚書宇，趙聲蘭*

（云南中醫學院，云南昆明650500）

研究制備黃精酵素的發酵工藝。以淀粉酶活力、SOD酶活力、多糖及皂苷含量為指標，在單因素試驗基礎上采用響應面Box-Benhnken試驗設計優化微生物發酵過程。最終確定較優工藝為：糖添加量40%，料水比1∶10（g/mL），酵母菌接種量2.4%，靜置發酵3 d。以此為基礎，得到黃精酵素產品淀粉酶活力347.33 U/g，SOD酶活力131.95 U/g，多糖含量469.84 mg/g，皂苷含量1.39 mg/g，經發酵的酵素產品具有清香味，去除了生黃精的麻味和刺激性，適口性得以提高，可制備良好的黃精酵素食品。

黃精；發酵；酵素；酶活；多糖；皂苷

黃精為百合科黃精屬多年生草本植物，具有補氣養陰，健脾、潤肺、補腎等功效，是我國傳統藥食兩用資源。現代藥理學研究發現，黃精含有黃精多糖、甾體皂苷、黃酮、生物堿、氨基酸等成分，有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、提高免疫及調節血糖血脂等功效，具有較高的開發與應用價值［1］。然而，生黃精具有麻味、刺激咽喉，不宜生品服用［2］，使黃精的食療價值未能在日常生活中得到推廣應用。本研究應用微生物發酵技術發酵黃精，通過微生物發酵代謝可產生各種外源活性酶［3］（如SOD酶）或有益次級代謝產物，發酵過程中復合酶的破壁作用也有利于黃精中活性成分（如多糖、皂苷）溶出。通過補充這些外源活性物質，可以彌補現代食品加工方式及人類飲食結構改變引起的機體酶失衡及營養不均衡，促進機體正常新陳代謝、提高免疫等［4-5］。此外，通過發酵處理還可去除生黃精的刺激性成分，提高適口性，有利于黃精功能性食品的研究開發。

1　材料與方法

1.1試驗材料

原料：滇黃精的干燥根莖，購自云南綠生藥業有限公司。

試驗菌種：啤酒酵母，云南中醫學院食品微生物實驗室菌種。

1.2試驗方法

1.2.1黃精酵素制備工藝流程

取一定量黃精→清洗干凈→蒸餾水浸泡3 h→瀝干→用糖水打漿（調節糖水濃度及制漿料液比）→勻漿液→121℃滅菌20 min→接種酵母菌種→混勻→32℃靜置發酵→離心過濾→上清為黃精酵素液

1.2.2黃精酵素品質指標測定

淀粉酶活的測定［6］：按3，5-二硝基水楊酸法操作，以麥芽糖為標準品，在波長540 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線：Y=1.197x-0.029 7，R2=0.999。取稀釋至一定倍數的供試樣液與1%淀粉溶液反應，反應液按標準物質測定方法操作。其中，1 mL（g）酶在40℃條件下1 min水解1%淀粉產生1 mg麥芽糖所需酶量定義為1個酶活力單位（U）。

SOD酶活的測定［7-8］：按鄰苯三酚自氧化法操作。在一定條件下，1 mL反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定為一個活力單位。

多糖含量的測定［9］：按苯酚硫酸法操作。以葡萄糖為標準品，于波長490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線（Y=20.214 x-0.011 3，R2=0.998）。取一定量黃精酵素液，加入無水乙醇使含醇量達80%，靜置過夜，抽濾后棄上清液，殘渣用80%乙醇洗滌3次，低溫烘干，殘渣用蒸餾水溶解并定容至250 mL，得樣品供試液備用。取樣品供試液同標準物質測定方法操作，計算酵素樣中多糖含量。

皂苷含量的測定［10］：按香草醛高氯酸比色法操作，以人參皂苷Rb1為標準品，在波長545 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線（Y=33.947x-0.012 5，R2=0.997 3）。取一定量黃精酵素液，按1∶1的體積比用水飽和正丁醇萃取3次，取正丁醇相收集濃縮后得總皂苷粗提物，用熱蒸餾水溶解并定容至100 mL，得樣品供試液備用。取樣品供試液同標準物質測定方法操作，計算酵素中總皂苷含量。

1.2.3試驗設計

1.2.3.1單因素試驗

為得到較優黃精酵素發酵工藝，在其他條件保持不變時，分別考察不同發酵條件：發酵時間（1、2、4、6、8、10 d）、接種量（0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%）、基質中加糖量（5%、10%、15%、20%、30%、40%）、料水比［1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）］對酵素制備工藝的影響。以淀粉酶活力、SOD酶活力、多糖含量、皂苷含量為指標，采用綜合評分法進行數據分析。其中，酵素綜合品質應優先考慮酶活力，使酶活力達到最佳水平的基礎上，盡可能的在發酵過程中保留（或獲得）活性物質，使其含量達到較高水平。基于此目標對各指標進行權重系數確定，淀粉酶活力、SOD酶活力權重系數分別為0.4；多糖含量及皂苷含量權重系數分別為0.1。運用隸屬度綜合評分法［11］和賦予的權重進行加權求和即可得到各指標的綜合評分。其中隸屬度按下式計算：

式中：Ci為指標值；Cmin為指標最小值；Cmax為指標最大值。

1.2.3.2響應面法優化黃精酵素發酵工藝

根據單因素試驗結果，以酵素的淀粉酶、SOD酶活力及多糖、皂苷含量4個指標為響應值，選取發酵時間、接種量、基質中加糖量及料水比作為響應面優化的因素進行Box-Benhnken設計，并應用Design Expert軟件對試驗數據進行回歸分析得出黃精酵素制備的最佳發酵工藝條件［12-13］。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

不同發酵時間對各指標的影響見圖1。

圖1　發酵時間對各指標的影響Fig.1Effect of fermentation time on different index

圖1結果顯示隨著發酵時間的延長，當發酵到第4天時黃精酵素的綜合評分最高，酶活及活性成分的含量均呈現較高水平，發酵時間超過4 d，微生物代謝活動逐漸減慢，綜合評分呈下降趨勢，SOD酶活不斷減弱，且隨著發酵時間延長，基質中營養成分被消耗而不足以滿足過多菌體所需，微生物會分解皂苷、多糖等成分以維持自身生長所用，導致其含量降低。

不同接種量對各指標的影響見圖2。

圖2中顯示從接種量0.5%開始，隨著接種量增加黃精酵素的綜合評分不斷上升，達到4%時評分最高，之后開始降低。SOD酶、淀粉酶活及皂苷含量在接種量為2%～8%范圍內均穩定維持在相對較高水平，而接種過量除了菌體競爭營養物質造成供給不足，過量生長的菌體產生的各種代謝產物也會影響菌體正常生長，造成產酶活減弱等［14］。

不同糖添加量對各指標的影響見圖3。

圖2　接種量對各指標的影響Fig.2Effect of inoculum concentation on different index

圖3　糖添加量對各指標的影響Fig.3Effect of addition level of sugar on different index

圖3中顯示隨著基質中糖添加量的增加，黃精酵素的各項指標及綜合評分不斷上升，但為了維持基質中適宜的滲透壓，并防止可直接利用營養過剩造成菌體提前進入衰亡期，糖添加量控制在30%～40%范圍內。

不同料水比對各指標的影響見圖4。

圖4　料水比對各指標的影響Fig.4Effect of ratio of material to water on different index

圖4中顯示隨著料水比增加，黃精酵素的綜合評分不斷上升，在料水比1∶6（g/mL）～1∶10（g/mL）時達到較高值并維持相對穩定水平。調節基質中適宜的含水量有利于菌體對營養物質的吸收，可維持培養基適宜的疏松度避免干化或黏粘，并防止含水過多造成菌體缺氧等。綜上所述，分別選取發酵時間3、4、5 d；接種量2%、4%、6%；加糖量30%、35%、40%；料水比1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）水平進行響應面設計。

2.2響應面優化試驗結果與分析

2.2.1響應面分析因素的選取及回歸模型建立與分析［15-16］

在單因素試驗基礎上，對發酵時間、接種量、基質中加糖量及料水比4個因素進行Box-Benhnken設計，設計24個析因點，重復5次零點試驗以估計誤差。設計方案及響應值結果見表1、表2。

表1　試驗設計因素和水平Table 1Factors and Levels

表2　黃精發酵的Box-Behnken試驗設計及結果Table 2Design and results of fermentation for Rhizoma polygonati

續表2黃精發酵的Box-Behnken試驗設計及結果Continue table 2Design and results of fermentation for Rhizoma polygonati

表3　以淀粉酶活性為響應值的自變量方差分析Table 3Variance analysis for the developed quadratic regression model of amylase activity

表4　以SOD酶活性為響應值的自變量方差分析Table 4Variance analysis for the developed quadratic regression model of SOD activity

續表4以SOD酶活性為響應值的自變量方差分析Continue table 4Variance analysis for the developed quadratic regression model of SOD activity

表5　以多糖含量為響應值的自變量方差分析Table 5Variance analysis for the developed quadratic regression model of polysaccharide content

表6　以皂苷含量為響應值的自變量方差分析Table 6Variance analysis for the developed quadratic regression model of saponin content

分別以淀粉酶活性、SOD酶活力活性、多糖含量、皂苷含量作為響應值，應用Design Expert軟件對表2試驗數據進行回歸分析，分別建立了淀粉酶活性（Y淀粉酶活性）、SOD酶活力活性（YSOD酶活性）、多糖含量（Y多糖含量）、皂苷含量（Y皂苷含量）4個指標的回歸模型，各回歸模型方程如下：

以淀粉酶活力為指標的二次回歸模型P值為＜0.000 1＜0.01，表明模型達極顯著水平，以SOD酶活力、多糖含量、皂苷含量為指標的模型P值分別為0.0486、0.0214、0.039，均小于0.05，表明模型顯著。淀粉酶活力、SOD酶活力、多糖含量、皂苷含量4項指標的判斷系數（R2）分別為0.936 7、0.921 4、0.908 3、0.926 5，說明試驗結果與模型擬合程度良好。

對各自變量進行方差分析以進一步對回歸系數做顯著性檢驗，表3～表6結果顯示：各因素影響淀粉酶活性的主次順序為：料水比＞加糖量＞發酵時間＞接種量，其中基質加糖量（C）和料水比（D）對酵素淀粉酶活力影響達極顯著水平（P＜0.01）；各因素影響SOD活性的主次順序為：發酵時間＞加糖量＞料水比＞接種量；各因素影響多糖含量的主次順序為：加糖量＞接種量＞料水比＞發酵時間，其中基質中加糖量（C）對酵素中多糖含量影響達顯著水平（P＜0.05）；各因素影皂苷含量的主次順序為：料水比＞發酵時間＞加糖量＞接種量。

2.2.2因素交互作用分析

表3方差分析結果顯示，以淀粉酶為響應值時交互作用項CD的P值＜0.01，影響極顯著，該兩個因素交互作用的響應面和等高線圖見圖5。

由圖5可知，在基質加糖量范圍內，隨著料液比的增加，淀粉酶活力不斷增大。基質中的加糖量與料水比兩個因素共同影響了培養基中的滲透壓，糖溶液濃度越高，滲透壓越大，過高的滲透壓可能會造成微生物失水死亡，不利于菌體生長，影響產酶。試驗結果顯示，在加糖量30%～40%范圍內，料液比增大至1∶10（g/mL）水平時基質中糖濃度稀釋到適宜菌體生長的良好環境，有利于其代謝產酶，顯示出較高的酶活力。

圖5　加糖量和料水比的交互作用對淀粉酶活性的影響Fig.5Response surface and contour plot for the interactive effects of addition level of sugar and ratio of material to water on amylase activity

表4分析結果可知，以SOD酶為響應值時交互作用項AC的P值為0.024＜0.05，影響顯著，該兩個因素交互作用的響應面和等高線圖見圖6。

由圖6可知，當發酵時間小于4.5 d，隨著基質中糖添加量的增加，SOD酶活性逐漸上升，當發酵時間大于4.5 d時，酶活性反而出現隨糖添加量的增加而降低的趨勢。基質中糖添加量越多，菌體可直接利用的營養越多，會迅速生長繁殖，代謝活動加強，有利于其產酶，呈現酶活力增強，但如果發酵時間延長，菌體長期處于旺盛生長狀態會提前進入衰亡期，使產酶能力減弱，因此，應協調糖添加量與發酵時間的關系，如果糖加量多，應縮短發酵時間以利于菌體適度生長。

圖6　發酵時間和加糖量的交互作用對SOD酶活性的影響Fig.6Response surface and contour plot for the interactive effects of time and addition level of sugar on SOD activity

表5方差分析結果顯示，基質中加糖量和接種量對多糖含量的影響程度最大，圖7為固定發酵時間和料水比，BC兩自變量對多糖含量的交互效應。

圖7　加糖量和接種量的交互作用對多糖含量的影響Fig.7Response surface and contour plot for the interactive effects of addition level of sugar and inoculation amount on polysaccharide content

由圖7可知，在基質加糖量范圍內，隨著接種量的增加，多糖含量不斷降低。接種量的增加帶來基質中菌體密度增高，使得基質中有限的營養物質逐漸被消耗，微生物先分解易吸收利用的小分子糖等，直至供給不足會分解多糖等物質供生長代謝活動所用，造成其含量下降，而且過量繁殖的菌體在發酵過程中產生的部分物質會改變基質內環境，干擾菌體代謝活動，影響酵母多糖等代謝產物的生成。

以皂苷含量為響應值時交互作用項CD的P值為0.035 4＜0.05，影響顯著，該兩個因素交互作用的響應面和等高線圖見圖8。

圖8　加糖量和料水比的交互作用對皂苷含量的影響Fig.8Response surface and contour plot for the interactive effects of addition level of sugar and ratio of material to water on saponin content

由圖8可知，當基質中糖添加量小于37.5%時，隨著料水比增加，皂苷含量逐漸增加，當糖添加量超過37.5%時，隨著料水比增加，皂苷含量有所下降。基質中的加糖量與料水比（加液量）兩個因素共同影響培養基中的滲透壓，當兩者比例適當構成了適宜菌體生長的外環境，溶解在水中的糖作為可直接利用的正營養因子會促進菌體生長，尤其是含量越高，營養越豐富，菌體生長繁殖越迅速，但是過度繁殖，當營養不足以滿足過高的菌濃度時，菌體會將皂苷等成分當做營養物質分解，造成其含量下降。

2.2.3黃精發酵最優工藝參數的確定

工藝優化以淀粉酶活力、SOD酶活力及多糖含量和皂苷含量4項指標的綜合評分為最終的響應值，運用隸屬度綜合評分法和賦予的權重進行加權求和得到各指標的綜合評分結果見表7。

表7　各指標綜合評分Table 7Comprehensive score value of different index

表8　模型回歸系數顯著性檢驗結果Table 8Significance of coefficients of quadratic regression model

利用Design Expert軟件對綜合評分結果進行二次多項回歸擬合，得到各因素對產品綜合評分的回歸方程：

該模型P值0.001 6＜0.01，表示試驗模型極顯著。模型的決定系數R2=0.944，說明此模型擬合程度良好，可用此模型對黃精酵素發酵工藝進行分析和預測。表8模型回歸系數顯著性檢驗結果顯示，各因素影響酵素綜合評分的主次順序為料水比＞加糖量＞發酵時間＞接種量，其中因素C和D的P值＜0.01，表明加糖量和料水比對酵素綜合評分的影響達極顯著水平，因素A的P值＜0.05，說明發酵時間對黃精酵素綜合評分影響顯著。

應用Design-Expert軟件對試驗模型進行分析，得到黃精發酵的最佳工藝條件：發酵時間3 d，接種量2.4%，基質中加糖量為40%，料水比1∶10（g/mL），在此點預測所得黃精酵素的綜合評分為0.933 7，重復3次進行驗證試驗，發酵黃精得到黃精酵素各項指標的平均值為淀粉酶347.33 U/g，SOD酶131.946 7 U/g，多糖含量469.84 mg/g，皂苷含量1.39 mg/g，其綜合評分為0.909 9，與預測值基本接近，說明響應面優化工藝有效。

3　結論

黃精發酵過程中基質糖添加量、料水比及發酵時間3個因素對酵素綜合品質指標均有顯著影響，通過綜合指標優化，確定最佳發酵工藝參數為糖添加量40%，料水比1∶10（g/mL），接種量2.4%，發酵時間3 d。以此工藝條件為基礎，得到黃精酵素食品淀粉酶活力347.33 U/g，SOD活力131.95 U/g，多糖含量469.84 mg/g，皂苷含量1.39 mg/g，其綜合評分為0.909 9，與預測值基本接近，說明響應面優化工藝有效。發酵后所得酵素食品具有清香味，去除了生黃精麻味和刺激性，為以黃精為主的功能性食品開發奠定一定基礎。

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A Preliminary Research of Fermentation Conditions of Rhizoma polygonati

YANG Jing-juan，ZHANG Xi，TAN Shu-yu，ZHAO Sheng-lan*
（Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，Yunnan，China）

The fermentation conditions were investigated in the preparation of Rhizoma polygonati ferment.The amylase activity，SOD activity，polysaccharide and saponin content were taken as index，the single factor experiment and response surface Box-Benhnken design were employed to optimize the fermentation conditions by yeast.At the optimum fermentation conditions，40%sugar addition level in the medium，1∶10（g/mL）of the materials/water ratio at inoculation amount 2.4%for 3 days，the ferment production amylase activity was 347.33 U/g，SOD activity was 131.95 U/g，polysaccharide content was 469.84 mg/g，saponin content was 1.39 mg/g，and the production was faint scent as the irritation of crude Rhizoma polygonati was removed.It was indicated that fermentation was a feasible approach for the preparation of Rhizoma polygonati ferment food.

Rhizoma polygonati；fermentation；ferment；enzyme activity；polysaccharide；saponin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.020

2015-10-16

云南中醫學院大學生創新訓練計劃項目（30270101600）；云南省應用基礎研究計劃項目青年項目（2016FD054）

楊婧娟（1986—），女（白），助教，碩士，研究方向：天然產物研究與開發。