固相萃取-高效液相法測定芝麻油中苯并（a）芘

蔣珍菊，王雁，楊巧

（西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039）

固相萃取-高效液相法測定芝麻油中苯并（a）芘

蔣珍菊，王雁，楊巧

（西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039）

建立一種快速、高效測定芝麻油中苯并（a）芘的固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）方法。樣品前處理采用硅膠固相萃取柱串聯氧化鋁固相萃取小柱，稀釋液和淋洗液選擇正己烷，洗脫液選擇二氯甲烷，在40℃下氮吹干后，乙腈復溶后檢測。采用Waters RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈-水（90∶10）作為流動相，用熒光檢測器檢測，外標法峰面積定量。結果表明，苯并（a）芘在1.00 ng/mL～20.00 ng/mL濃度范圍內線性良好，相關系數r2為0.999 8，檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.16 μg/kg，加標回收率達到92.2%～98.5%。

高效液相；芝麻油；苯并（a）芘

苯并（a）芘（BaP）是一種多環芳烴，分子結構式如圖1所示，化學性能穩定，在烹調過程中不易被破壞，是多環芳烴類化合物中致癌性最強的一種物質，可以通過食物和飲水進入人體，人群流行病研究表明，食品中苯并芘含量與多種腫瘤的發生有關系，如乳腺癌、肺癌等［1-2］。植物油中含苯并（a）芘的主要原因包括：油料在曬干、煙熏、炒制過程中可產生苯并（a）芘；用溶劑浸出法制油時，所用溶劑中含有多環芳烴；油受熱溫度過高和時間較長時可生成苯并（a）芘。在標準GB 2762-2012《食品安全國家標準食品中污染物限量》中規定了油脂及其制品苯并（a）芘限量值為10 μg/kg［3］。

圖1　苯并（a）芘結構圖Fig.1Structure of benzo（a）pyrene

現有檢測苯并（a）芘的方法有熒光分光光度法［4］、氣相色譜法［5］、高效液相色譜［6］等，其中高效液相色譜-熒光法為常用檢測方法。參考標準GB/T 22509-2008《動植物油脂苯并（a）芘的測定：反相高效液相色譜法》中檢測動植物油脂中苯并（a）芘的方法［7］，需要先自行處理中性氧化鋁至Ⅳ級活度，再填裝層析柱，對操作者的實驗技能要求較高、溶劑消耗量大、步驟復雜，難以保證結果的準確性和重現性，使得苯并（a）芘的檢測工作實驗室推廣存在一定難度。本試驗在前處理過程中改用商業化苯并（a）芘專用固相萃取柱，優化了前處理的條件，使整個前處理過程簡單化，這樣使得并（a）芘的檢測既能保證準確性和重復性，又能滿足簡單快捷的要求。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

2695高效液相色譜系統、2475熒光檢測器：Waters；RV10旋轉蒸發儀：IKA。

甲醇中苯并（a）芘溶液標準物質（4.95 μg/mL）：購于中國計量科學研究院；甲醇、乙腈為色譜純。

Cleanert BAP-3氧化鋁固相萃取小柱（活度為Ⅳ級）、Cleanert Si硅膠固相萃取柱：博納艾杰爾，3cc。

1.2樣品來源

樣品均為隨機抽取市場上銷售的芝麻油。

1.3色譜條件

色譜柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

柱溫：30℃；流動相：乙腈+水。

熒光檢測器：發射波長：406nm，激發波長：384 nm。

1.4方法

1.4.1流動相體系中乙腈-水比例對苯并（a）芘色譜行為的影響

固定流動相洗脫速度，流動相選擇不同的乙腈-水體積比例，流動相組成Ⅰ：乙腈-水（84∶16）；流動相組成Ⅱ：乙腈-水（88∶12）；流動相組成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流動相組成Ⅳ：乙腈-水（92∶8）；考察對苯并（a）芘分析效果和出峰時間的影響，確定最佳流動相比例。

1.4.2標準曲線的制作

吸取適量的苯并（a）芘標準品，配制成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL標準溶液，進液相色譜儀進行分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.3樣品前處理條件的優化

在按標準方法［7］處理時，選用的是氧化鋁柱作為苯并（a）芘的吸附載體，但是在實際試驗中效果并不理想，雜質干擾峰較多，加標回收率不高，所以本試驗選用Cleanert BAP-3小柱，對樣品進行固相萃取的優化。針對芝麻油，還會在Cleanert BAP-3小柱前串聯Cleanert Si硅膠固相萃取柱，來比較優化前后的效果。結果都以樣品加標平均回收率為比較依據，來制定較優的前處理條件。

1.4.4加標回收試驗

以未檢出苯并（a）芘的芝麻油為空白基質，分別加入標準溶液40.0 ng，選擇優化后的前處理條件操作，氮吹近干后再用流動相定容至2.0 mL，過0.22 μm濾膜后上機檢測，計算回收率。

2　結果與分析

2.1乙腈-水溶液體系對苯并（a）芘色譜行為的影響

為了了解乙腈-水溶液對苯并（a）芘色譜行為的影響，本研究固定流動相洗脫速度，改變乙腈-水的比例，流動相組成Ⅰ：乙腈-水（84∶16）；流動相組成Ⅱ：乙腈-水（88∶12）；流動相組成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流動相組成Ⅳ：乙腈-水（92∶8），考察對苯并（a）芘色譜行為的影響。結果表明：在乙腈-水溶液體系中，乙腈-水比例的不同對苯并（a）芘的色譜保留行為有不同程度的影響，其乙腈比例與苯并（a）芘保留因子的相互關系符合lnk=a+cCB方程［8-10］（其中k是保留因子，CB是流動相中強溶劑的濃度），且具有良好的線性（r2＞0.99）。當比例在乙腈-水（90∶10）時，苯并（a）芘在RP C18柱上可得到良好的基線分離，其峰型良好，如圖2所示。

2.2標準曲線、檢出限和定量限

為了驗證苯并（a）芘在乙腈-水（90∶10）溶液流動相體系中的線性關系，配制了濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL的系列標準溶液。每個濃度重復測定5次，試驗結果表明，苯并（a）芘在1.00 ng/mL～20.00 ng/mL內均具有良好的線性關系（r2＞0.99）；采用在空白基質中添加目標組分的方法，依據色譜峰的性噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到目標組分的LOD和LOQ分別為0.05 μg/kg和0.16 μg/kg，結果見表1。

2.3串聯硅膠固相萃取柱的選擇

考慮到芝麻油樣品含油量比較高，直接用氧化鋁固相萃取小柱處理后的樣液較混濁，容易形成懸浮液。所以本試驗選擇在氧化鋁固相萃取小柱前面串聯硅膠固相萃取柱去油（圖3中的B圖），與沒有串聯硅膠固相萃取柱（圖3中的A圖）進行比較，結果以苯并（a）芘的回收率為比較依據。

圖2　苯并（a）芘標準物質色譜圖Fig.2Standard substance chromatogram of benzo（a）pyrene

表1　苯并（a）芘的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of benzo（a）pyrene

結果顯示：在樣品串聯硅膠固相萃取柱后，處理后的樣液澄清，不易形成懸浮液，樣液上機后的色譜圖中雜質干擾峰減少，樣品的加標回收率高于未串聯硅膠固相萃取柱，所以以下試驗都選擇氧化鋁固相萃取小柱前面串聯硅膠固相萃取柱，結果如圖3所示。

2.4固相萃取稀釋液、淋洗液、洗脫液以及加標方式的條件優化

參考相關標準和產品資料，在固相萃取步驟，對芝麻油樣品的稀釋液分別選擇正己烷、石油醚和乙醚3種溶劑進行比較；淋洗液也相應的選擇正己烷、石油醚和乙醚3種溶劑；洗脫液分別選擇正己烷、二氯甲烷、石油醚和乙醚4種溶劑，結果以苯并（a）芘的回收率為比較依據。

圖3　串聯硅膠柱選擇對苯并（a）芘色譜圖的影響Fig.3The effect of selecting silica gel column on the benzo（a）pyrene chromatogram

對于加標回收試驗，由于標準品是溶于甲醇里的，考慮到與樣品互溶性的問題，比較兩種加標方式Ⅰ：將標準品直接加入到樣品里，Ⅱ：將標準品加入容器氮吹干后，樣品加入容器里。

結果顯示：在固相萃取步驟，樣品的稀釋液和淋洗液選擇正己烷結果要略好于石油醚和乙醚，洗脫液選擇二氯甲烷結果要優于其它3種溶劑；對于加標回收試驗，加標方式Ⅱ明顯優于加標方式Ⅰ，結果如圖4所示。

圖4　稀釋液、淋洗液、洗脫液、串聯硅膠柱以及加標方式的選擇對苯并（a）芘平均回收率的影響Fig.4The effect of dilution solution，leaching solution，elution solution，tandem silica gel column and addition standard method on the average recovery rate of benzo（a）pyrene

2.5樣品的測定及加標回收

在我們隨機抽取的20個批次的芝麻油成品中，根據上述實驗結果選用正己烷稀釋樣品，正己烷淋洗，二氯甲烷洗脫后，洗脫液在40℃下氮吹干后，2 mL乙腈定容后，上機檢測。結果表明：用硅膠固相萃取柱串聯固相萃取柱后，雜質峰對目標峰的干擾明顯少于凈化前。在所檢測的芝麻油樣品中，苯并（a）芘超標的有1個樣品，加標回收率92.2%～98.5%，符合檢測要求。

3　結論

本文建立了一種固相萃取-反相高效液相色譜法檢測芝麻油中苯并（a）芘的分析方法，結果表明：在乙腈-水（90∶10）體系中，乙腈比例對于溶質的色譜保留行為具有較強的調節能力，苯并（a）芘得到了良好的基線分離；固相萃取階段，樣品上住后稀釋液和淋洗液選擇正己烷，洗脫液選擇二氯甲烷，效果較好；加標實驗中，先將標準品加入容器氮吹干后，樣品再加入容器里后，對試驗干擾更小；在氧化鋁固相萃取柱前面串聯硅膠固相萃取柱可有效去除芝麻油中的復雜基質對目標峰的影響。本試驗加標回收率為92.2%～98.5%，最低檢出量為0.05 μg/kg，滿足國標中對植物油中苯并芘的檢測要求。該法樣品預處理簡單，試劑消耗少、分析時間短，明顯提高了檢測效率，且其準確性和精密度好，可實現對苯并（a）芘的凈化與富集，是測定芝麻油中苯并（a）芘含量的理想方法。

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Determination of Benzo（a）Pyrene in Sesame Oil by Solid-phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

JIANG Zhen-ju，WANG Yan，YANG Qiao
（School of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of benzo（a）pyrene in sesame oil by solid－phase extraction coupled with high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.The samples were treated by silica gel SPE tandem alumina solid-phase extraction column，and the leaching solution of nhexane，the eluent of dichloromethane.The elution liquid was dried at 40℃under nitrogen，and detected after re-dissolution with acetonitrile.The separation of targeted compound was performed on a Waters RP C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile-water（90∶10）as mobile phase，with fluorescence detector and external standard method peak area quantification.The linear range of benzo（a）pyrene was in the range of 1.00 ng/mL-20.00 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 8.The detection limit was 0.05 μg/kg and the quantitative limit was 0.16 μg/kg.The recovery rate was 92.2%-98.5%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sesame oil；benzo（a）pyrene

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.026

2016-06-03

教育部春暉計劃（Z2015116）；四川省三創項目資助（201510623086）

蔣珍菊（1974—），女（漢），教授，博士，研究方向：應用化學、食品質量與安全。