高效液相色譜法測定藍莓干中的原花青素含量

劉連新，劉郁，何偉平，田龍

（徐州工業職業技術學院化學工程學院，江蘇徐州221140）

高效液相色譜法測定藍莓干中的原花青素含量

劉連新，劉郁，何偉平，田龍

（徐州工業職業技術學院化學工程學院，江蘇徐州221140）

建立高效液相色譜測定藍莓干中的原花青素的含量，用于評價產品的優劣。色譜條件：DiamonsilC18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為甲醇、乙腈與水，比例為75∶20∶5；流速：1 mL/min；檢測波長為280 nm。該方法對原花青素具有良好的線性，Y=5 756.85X+2 715（0～100 μg/mL），R2=0.999 5；重復性和精密度良好，樣品加標回收率在99.83%。RSD=0.204 0%。

HPLC；藍莓；原花青素

藍莓（Blueberry）又稱越橘、藍漿果，杜鵑花科越桔屬多年生落葉或常綠灌木，果實為漿果，近圓形，呈藍色，酸甜適度，果肉細膩，皮薄籽小。藍莓是越橘屬植物中營養成分最豐富的種類，除含常規的有機酸、糖以外，還富含多種維生素、超氧化物歧化酶、不飽和脂肪酸、礦物質等成分，以及原花青素、黃酮、尼克酸等特殊成分。原花青素（Origin Proanthocyanidin，OPC）是一大類多酚類化合物的總稱。基本組成單元是兒茶素和表兒茶素，上下單元間以4-8或4-6位C-C鍵相連，形成具有不同聚合度的混合體。原花青素具有很強的抗氧化和消除自由基的生理活性，其抗自由基氧化能力大約為維生素E的50倍，維生素C的20倍；具有抗高血壓、內皮依賴性血管舒張活性、抗缺血-再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化以及抗血小板凝固等作用；對多種癌細胞如乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、皮膚癌細胞等都具有不同程度的抑制作用；還可以促進與調節眼睛中視網膜中的視紫質再生，預防近視與提高視力。本文主要是研究采用微波提取藍莓干中原花青素的方法，用HPLC測定藍莓干中的原花青素的含量，根據含量可以評價該產品的優劣，來規范該產品質量的評價方法，提高并推進藍莓與加工產業的發展。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

KQ-100B超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；L2000高效液相色譜儀：日本日立株式會社；Milli-Q Advantage Merck Millipore純水機：Merck Millipore USA；201s賽多利斯電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司。

藍莓干：吉林產；原花青素：上海哈靈生物科技有限公司，HL20150612；乙腈、甲醇：sigma公司生產，為HPLC級別；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1HPLC色譜測試條件［1-3］

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。

1.2.2對照品溶液的制備

精密稱取原花青素對照品0.002 5 g，置于25 mL容量瓶中，先用部分甲醇溶解，超聲10 min，定容，超聲，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得100 μg/mL的對照品貯備溶液。

1.2.3樣品溶液的配制

取藍莓干樣品1.500 0 g，切碎，加入不低于80%的甲醇15mL，加入磷酸調節pH=3.5，溫度控制在80℃，微波提取45 min。過濾提取液體，取上清液0.5 mL，用甲醇稀釋到50 mL。樣品用0.25 μm的微孔濾膜過濾，得待測樣品溶液，裝入樣品瓶中，備用。

2　結果與討論

2.1進樣精度

按照1.2.2項下對照品溶液制備方法，配制溶液，按照1.2.1項下的色譜方法測定，記錄峰面積，結果見表1所示，相對標準偏差（RSD）為0.317 9%。

表1　精密度試驗（n=6）Table 1Precision experiment（n=6）

2.2標準曲線的繪制

分別精密移取對照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分別置于5 mL的棕色容量瓶中用甲醇稀釋，超聲、定容、用0.25 μm微孔濾膜過濾，注入樣品瓶。按照1.2.1項下的液相方法測定，記錄峰面積。以對照品進樣濃度以（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線方程為Y=5 756.85X+2 715（0～100 μg/mL），結果見表2所示，HPLC色譜圖見圖1所示。

表2　濃度與面積關系Table 2Relationship of concentration and peak area

圖1　原花青素標準品色譜圖Fig.1HPLC chromatogram of standard substance of origin proanthocyanidin

2.3穩定性試驗

取濃度為10 μg/mL的對照品溶液適量，分別放置于室溫陰暗處1、2、4、6 h，按照1.2.1項下的液相方法測定，計算峰面積與含量。結果原花青素的RSD為0.781%，表明供試品溶液在6 h內穩定性良好。

2.4回收率試驗

精密稱取0.1mL的標準液，按“1.2.2”的制備方法及“1.2.1”項條件液相方法進行測定，進樣分析，每個平行3次平行測定，計算其回收率。結果表明，平均回收率為99.83%，RSD為0.204 0%。結果詳見詳見表3所示。

表3　回收率試驗Table 3Recovery ratio experiment

2.5樣品含量測定［4-5］

取樣品若干個，按照1.2.1項下的液相方法測定。記錄峰面積，根據線性關系計算原花青素的含量結果見表4所示，平均含量在29.97 mg/g，RSD為1.210 8%，色譜圖見圖2所示。

表4　藍莓干中原花青素的含量Table 4The content of PC in Blueberry

圖2　藍莓樣品色譜圖Fig.2HPLC chromatogram of blueberry sample

2.6討論

2.6.1原花青素提取條件的選擇

根據原花青素的性質，可以采用的提取溶劑有水、甲醇以及乙醇等。通過文獻查閱以及前期的預作試驗，確定甲醇為提取溶劑，甲醇濃度不低于80%（體積分數），用磷酸調節提取溶劑的pH=3.5，提取溫度為80℃，提取時間為45 min。

2.6.2原花青素的提取方式

本研究在樣品制備過程中采用微波提取，微波具有加熱速度快，溫度穩定，而且在加熱過程中沒有氧氣，這樣可以減少樣品的氧化過程，提高了原花青素的穩定性，而且雜質含量較低。在微波提取過程中，采用攪拌子進行攪拌，速度為600 r/min。

2.6.3原花青素的穩定性

在穩定性的考察時，只考慮了1、2、4、6 h，因為原花青素的穩定性受周圍光、氧氣、溫度等因素的影響，一般應控制在3 h之內檢測，不建議放置時間過長。

3　結論

采用HPLC色譜法測定藍莓干中原花青素的含量，紫外檢測器，檢測波長：280 nm，流量：1.0 mL/min，進樣量：20 μL，流動相：甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20，檢測溫度為室溫。該方法可以根據測定的原花青素的含量，評價產品的優劣。

［1］劉郁，劉連新，燕傳勇，等.高效液相色譜法測定茶飲料中阿斯巴甜的含量［J］.現代食品科技，2012，28（12）：1810-1812

［2］劉郁，張念潔，劉連新，等.采用HPLC方法測定氟伐他汀鈉分散片的含量［J］．吉林化工學院學報，2011，28（1）：23-25

［3］周瑋婧，孫智達，謝筆鈞，等.荔枝皮原花青素提取、純化及抗氧化活性研究［J］.食品科學，2009，30（8）：68-71

［4］劉連新，劉郁，時光霞，等.液相色譜測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的方法研究［J］.食品研究與開發，2014，35（21）：103-105

［5］時光霞，劉郁，劉連新，等.紅葡萄酒中合成色素的測定研究［J］.食品研究與開發，2014，35（10）：109-111

Determination of Proanthocyanidin in Blueberry by HPLC

LIU Lian-xin，LIU Yu，HE Wei-ping，TIAN Long
（School of Chemical Engineering，Xuzhou College of Industrial Technology，Xuzhou 221140，Jiangsu，China）

To evaluate the quality of the products，the HPLC method for the determination of the content of origin proanthocyanidin in blueberry was established.HPLC chromatographic conditions：Diamonsil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）chromatographic column，flow phase：methanol∶acetonitrile∶water=75∶20∶5；flow rate was 1 mL/min，detection wavelength at 280 nm.The method had good linear relation，Y=5 756.85X+2 715（0-100 μg/mL），R2=0.999 5.The repeatability and precision were good，and the recovery rate was 99.83%.RSD= 0.204 0%.

HPLC；blueberry；origin proanthocyanidin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.029

2016-03-25

劉連新（1971—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：檢驗方法與數據處理。