溫敏含糖嵌段共聚物的合成及其膠束的自組裝*

周開春，徐慕儒，武俊紫，權　靜,2

(1.東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620; 2.東華大學 生態紡織教育部重點實驗室,上海 201620)

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溫敏含糖嵌段共聚物的合成及其膠束的自組裝*

周開春1，徐慕儒1，武俊紫1，權靜1,2

(1.東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620; 2.東華大學 生態紡織教育部重點實驗室,上海 201620)

采用酶促法合成含半乳糖單體6-O-乙烯基壬二酸-D-吡喃型半乳糖酯(OVZG),采用可逆加成-鏈斷裂轉移自由基聚合法(RAFT聚合)將大分子引發劑二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)和OVZG有效結合，制備相對分子質量(簡稱分子量)分散系數(PDI)較低的溫敏性含半乳糖嵌段共聚物PDEGMA-b-POVZG。通過核磁共振氫譜(1H NMR)，傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)，凝膠滲透色譜(GPC)對聚合物結構進行了確認表征。通過紫外-可見光譜(UV-Vis)研究表明，共聚物的低臨界溶解溫度(LCST)可以通過共聚單體的比例進行調控，當PDEGMA與OVZG的物質的量之比為1∶63時，含糖共聚物的LCST值為33℃。在37℃生理溫度下，PDEGMA-b-POVZG可以自組裝形成納米膠束，透射電子顯微鏡(TEM)顯示自組裝形成的聚合物膠束是結構均勻、形貌規整的球形，通過動態光散射(DLS)測得納米微球的粒徑約為167 nm，該溫敏性半乳糖嵌段共聚物在藥物載體方面具有潛在的應用前景。

溫度敏感性；含糖嵌段共聚物；LCST；自組裝

0　引　言

近年來，隨著兩大新型活性聚合反應可逆加成-斷裂鏈轉移自由聚合(RAFT)和原子轉移自由基聚合(ATRP)[1]的廣泛應用，使得可控聚合迅速發展起來。RAFT聚合由于其適用單體范圍較廣，反應過程比較簡單，所以成為合成具有生物醫藥用途的含糖聚合物的最佳方法之一。Lowe[2]等首次使用RAFT聚合法合成了分子量分散窄的含糖均聚物。

溫敏性雙親水含半乳糖嵌段共聚物是一類特殊的兩親性共聚物,在溫度變化的誘導下可以轉化為兩親性,從而形成對溫度變化敏感的聚集體[3]。半乳糖單體作為1種具有良好的親水性、細胞靶向識別性、生物相容性和生物降解性可被聚合到溫敏單體中形成溫敏性雙親水含半乳糖嵌段共聚物。而二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)是一類具有良好生物相容性，因而成為最常用的溫敏單體之一。由于其結合了半乳糖基的生物相容性、細胞靶向識別性和溫度敏感單體的環境刺激-響應性，使其在藥物傳遞和基因治療領域具有潛在的應用價值而備受關注。

以膠束為載體的給藥系統具有被動靶向的性能，將藥物包封或嵌入到膠束后能選擇性地聚集于靶組織并達到緩慢釋放藥物的目的，以更好地發揮藥物的療效。Wang[4]等研究表明，含半乳糖的嵌段共聚物膠束可以特異性靶向HepG2肝細胞。Voit等[5]研究表明，與聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)相比，DEGMA結構中沒有酰胺鍵，不易與生物體中的蛋白質、多肽發生化學反應，因而可廣泛運用于生物體內。同時，還表明將DEGMA與含糖單體聚合所得的共聚物兼具溫敏性，細胞靶向性和生物相容性[6-7]。

本文通過可逆加成-斷裂鏈轉移自由基聚合(RAFT聚合法)，將溫敏性單體二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)和具有肝靶向性的含半乳糖單體6-O-乙烯基壬二酸-D-吡喃型半乳糖酯OVZG進行嵌段共聚，制備分散度窄的半乳糖基溫敏性雙親水嵌段共聚物。通過對嵌段聚合物膠束的LCST的測定，聚合物在溫度高于33℃時，可以自組裝形成規整的球形納米膠束[8-9]。

1　實　驗

1.1主要試劑及儀器

枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(100 U/mg，無錫雪梅科技有限公司)、偶氮二異丁腈(AIBN，國藥集團化學試劑有限公司，AR)、壬二酸(國藥集團化學試劑有限公司，AR)、二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA，Sigma-Aldrich，AR)、醋酸乙烯酯(國藥集團化學試劑有限公司，AR)、半乳糖(國藥集團化學試劑有限公司，AR)、S-氰甲基-N-甲基-N-(4-吡啶基)氨基二硫代碳酸酯(CMPCD，Sigma-Aldrich，AR)，其余藥品均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。

Waters1525/2414 BI-MwA型凝膠滲透色譜(GPC)-散射(LS)聯用儀(美國Waters，Brookhaven公司，色譜柱的型號為Waters Styragel HT)、Avance400型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker 公司)、紫外可見分光光度計(Lambda 35，美國PerkinElmer公司)、透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本JEOL公司)、傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 6700，美國Thermo Fisher公司)、激光光散射儀(BI-200SM,美國Brookhaven公司)。

1.2PDEGMA-b-POVZG的合成

在枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的催化下經過轉酯反應獲得OVZG[10]。制備大分子引發劑，取1.13 g DEGMA、13.4 mg鏈轉移劑 CMPCD、引發劑 AIBN 2.1 mg，用 2 mL DMF溶劑溶解，經過3次抽真空-充氮氣處理，于70℃油浴中反應1 h，然后置于冰水浴中冷卻5 min。把反應產物用二氯甲烷溶解后，正己烷沉淀反復2～3次后，放入真空干燥箱干燥，得到0.83 g 黃色油狀物，即得大分子引發劑PDEGMA[11-12]。用RAFT 聚合合成PDEGMA-b-POVZG。OVZG與PDEGMA物質的量之比分別為63∶1。反應以DMF 為溶劑，以偶氮二異丁腈(AIBN)為引發劑，單體、鏈轉移劑、引發劑的物質的量之比為63:1:0.21，單體的質量濃度為1 kg/L。取301.7 mg PDEGMA、239.7 mg OVZG、0.35 mg AIBN 溶于0.5 mL DMF 中，經過3次抽真空-充氮氣處理，于70℃油浴中反應48 h，然后置于冰水浴中冷卻5 min。把反應產物用二氯甲烷溶解，正己烷沉淀，如此反復2次，放入真空干燥箱干燥，得到0.23 g 黃色油狀物。合成路線如下所示

1.3聚合物表征

1.3.11HNMR測定

將反應單體OVZG、PDEGMA 和合成的產物PDEGMA-b-POVZG通過1H NMR(400MHz；DMSO 或 CDCl3，Me4Si)進行表征。

1.3.2傅里葉紅外光譜測定

將反應單體 OVZG、PDEGMA 和合成的產物 PDEGMA-b-POVZG，通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)進行表征。

1.3.3凝膠滲透色譜(GPC)

將聚合物 PDEGMA-b-POVZG 溶于四氫呋喃配制4 g/L的溶液，通過凝膠滲透色譜(GPC)測試其分子量和分散度(PDI)。使用已知分子量的聚苯乙烯溶液作為標準參比分子。

1.3.4聚合物LCST值測定

將聚合物配制成1 g/L的水溶液放在帶有變溫池的紫外可見分光光度計中，測其在500 nm處的吸光度(A)隨溫度(T)變化的情況。測試條件：升溫范圍25～55℃，升溫速率為0.5℃/min。

1.3.5動態光散射測試(DLSC)

將 PDEGMA-b-POVZG 溶解在雙蒸水中，制備成質量濃度為0.5 g/L的溶液。用0.45 μm的水相過濾膜將樣品進行過濾，然后加入到干凈的樣品測試瓶中。使樣品室的溫度保持在25℃，在532 nm下進行動態光散射測試。

1.3.6膠束形貌的透射電子顯微鏡(TEM)表征

將嵌段聚合物溶解在三蒸水中，讓其自組裝形成膠束，然后將膠束溶液滴在備好的銅網上使水分蒸發制得樣品，通過透射電子顯微鏡觀測其表面形貌。

2　結果與討論

2.1核磁共振氫譜

圖1為反應單體 OVZG、DEGMA 和合成產物 PDEGMA-b-POVZG的核磁共振氫譜。

圖1OVZG、DEGMA、PDEGMA-b-POVZG 的核磁共振氫譜(1HNMR)

Fig 11HNMR spectra of OVZG,DEGMA and PDEGMA-b-POVZG

2.2紅外光譜

圖2PDEGMA、OVZG、PDEGMA-b-POVZG的紅外光譜圖

Fig 2 IR spectra of PDEGMA,OVZG and PDEGMA-b-POVZG

2.3GPC

圖3為PDEGMA-b-POVZG的GPC 圖，可發現其為對稱單峰。GPC 測試結果表明，聚合產物多分散系數為1.55，聚合物的質均相對分子質量(Mw)為120 600，其數均相對分子質量(Mn)為77 600。

圖3　共聚物凝膠滲透色譜(GPC)圖

2.4PDEGMA-b-POVZG共聚物的溫度敏感性

將嵌段聚合物(PDEGMA-b-POVZG)溶液放在帶有變溫池的紫外可見分光光度計中，測其在500 nm 處的吸光度(A)隨溫度(T)變化情況，如圖4 所示。

圖4PDEGMA-b-POVZG水溶液在500 nm處的吸光值A 曲線

Fig 4 Absorbance curves recorded for solution of PDEGMA-b-POVZG in water

根據定義[14]，低臨界溶解溫度(LCST)為達到溶液最大吸光度(A)50%時的溫度值。圖中可以看出該嵌段共聚物PDI的LCST值為33℃?？梢姡琍DEGMA-b-POVZG的LCST 值與人體的溫度比較接近。當溫度降到LCST以下時，膠束溶液又從混濁變得澄清，表明此類溫度敏感膠束的相轉變即溶解-不溶的轉變，這種轉變是可逆的。又由于 PDEGMA-b-POVZG的LCST 值為33℃，低于人體溫度，在人體環境中可以快速形成納米膠束，使其在體內藥物載體方面具潛在應用。

2.5動態光散射測試

圖5是 PDEGMA-b-POVZG 通過動態光散射得到的流體力學直徑圖，可發現其同樣為對稱單峰，且分布較為集中。平均粒徑為167 nm。

圖5　共聚物動態光散射(DLS)圖

2.6聚合物膠束的自組裝

圖6是質量濃度為0.5 g/L的嵌段聚合物溶液形成的膠束的表面形貌。

圖6　聚合物自組裝膠束透射電鏡(TEM)圖

Fig 6 TEM images of micelles self-assembled from PDEGMA-b-POVZG at low and high magnification

通過TEM的低倍和高倍圖可以觀察到，聚合物膠束為比較規整但表面不平滑的球形結構，粒子的大小比較均勻，粒徑約為167 nm。由于在制備TEM樣品時的溫度是50℃高于嵌段共聚物的LCST值33℃，所以可以形成比較規整的球形結構。但又由于制樣過程中膠束中的水分蒸發，因此，粒徑小于DLS測試得到的結果。同時膠束會發生不同程度的坍縮，使得膠束的表面出現不同程度的凹凸現象[15]。在PDEGMA-b-POVZG中，OVZG與PDEGMA 通過主鏈連接起來。常溫下溶于水后主鏈無規成團，溫度升高至LCST值后，溫敏部分 PDEGMA 向內發生塌縮，而含有半乳糖基部分OVZG位于膠束表面。

3　結　論

通過酶促合成/RAFT聚合的方法在鏈轉移劑S-氰甲基-N-甲基-N-(4-吡啶基)氨基二硫代碳酸酯(CMPCD)的作用下，將含半乳糖單體OVZG與溫敏性單體PDEGMA進行可控聚合制備了分散度小且具有溫敏性雙親水性的共聚物。當OVZG與PDEGMA 物質的量之比為63∶1時，LCST值為33℃，低于人體溫度。在此條件下可以成功形成結構規整的膠束，為該類材料在肝靶向藥物載體方面的應用奠定了基礎。

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Synthesis and self-assemble of thermosensitive galactose block polymer

ZHOU Kaichun1，XU Muru1,WU Junzi1,QUAN Jing1,2

(1.Donghua University,College of Chemistry,Chemical Engineering and Biotechnology, Shanghai 201620,China；2.Donghua University,Key Laboratory of Textile Science & Technology,Ministry of Education, Shanghai 201620,China)

The glycomonomer 6-O-vinylazelaic-D-galactopyranose(OVZG)was synthesized by lipase catalyzed transesterification of divinyladipate with D-galactopyranose.PDEGMA-b-POVZG with narrow polydispersity(PDI)and obvious thermosensitivity was effectively prepared via enzymatic synthesis combined with reversible addition-fragmentation chain transfer(RAFT)polymerization.The structure and molecular weight of the synthesized glycopolymer were characterized by1HNMR,FT-IR and gel permeation chromatography(GPC),respectively.Measurement by dynamic light scattering(DLS)and transmission electron microscopy(TEM)revealed that PDEGMA-b-POVZG was able to self-assemble into nano-micelles with well-defined structure and uniform size in aqueous solution.UV-Visible spectroscopy tests showed that the low critical solution temperature(LSCT)of the polymer can be controlled by the molar ratio of monomers.Especially,as the molar ratio of PDEGMA and OVZG was 1∶63,the LCST of PDEGMA-b-POVZG could be 33℃ in aqueous solution.The results demonstrate that PDEGMA-b-POVZG can form nano-micelles in the human body environments,which may have potential as functional drug carriers.

thermosensitivity；glycopolymer block；LCST；Self-assemble

1001-9731(2016)09-09158-05

國家自然科學基金資項目(21303014)

2015-06-08

2016-04-04 通訊作者：權靜，E-mail:jquan@dhu.edu.cn

周開春(1990-)，男，安徽滁州人，碩士研究生，師承權靜副教授，主要從事藥物緩釋材料研究。

O631；TQ316

ADOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.09.030