家族性肥厚型心肌病β-肌球蛋白重鏈基因篩查分析

施鑫，周炳元，趙彩明，林佳，周遊，楊俊華

(1 蘇州工業園區疾病防治中心，江蘇蘇州215021；2蘇州大學附屬第一醫院)

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家族性肥厚型心肌病β-肌球蛋白重鏈基因篩查分析

施鑫1，周炳元2，趙彩明2，林佳2，周遊2，楊俊華2

(1 蘇州工業園區疾病防治中心，江蘇蘇州215021；2蘇州大學附屬第一醫院)

目的探討中國漢族人群家族性肥厚型心肌病β-肌球蛋白重鏈基因(MYH7)的突變位點，分析基因型與表型的相關性。方法 對11例家族性肥厚型心肌病家系先證者進行MYH7基因掃描，聚合酶鏈反應擴增其功能區的外顯子片段，雙脫氧末端終止法測序。對陽性結果患者進行家系調查，收集臨床資料，分析其臨床表型特點。結果 在1個家系中發現MYH7基因c.428G>A突變，該突變使MYH7基因第143位氨基酸由精氨酸變為谷氨酰胺，該家系中2例患者心肌肥厚程度偏重，癥狀少，病程進展緩慢。結論 家族性肥厚型心肌病MYH7基因突變位點為c.428G>A，患者臨床癥狀不明顯，預后相對較好。

肥厚性心肌病；β-肌球蛋白重鏈；基因突變；臨床表型

肥厚型心肌病(HCM)是一種最常見的遺傳性心臟病，以左心室或右心室不稱性肥厚并累及室間隔為解剖特點，伴有左心室血液充盈受阻，舒張期順應性下降，屬于常染色體顯性遺傳。HCM約55%以上的病例有家族史[1]，也稱為家族性肥厚型心肌病(FHCM)。該病的致病基因主要集中于肌小節上，其中最常見的致病基因為β-肌球蛋白重鏈基因(MYH7)，占總致病基因的30%～50%[2,3]。目前已發現MYH7基因有190多種突變可致HCM。本文通過HCM家系篩查，研究MYH7基因在FHCM家系的突變情況。

1　資料與方法

1.1臨床資料2013～2014年就診蘇州大學附屬第一醫院無血緣關系的FHCM先證者11例，男3例、女8例，年齡24～70(49.1±16.2)歲；均符合HCM診斷標準：即超聲心動圖檢查室間隔或心室壁厚度≥13 mm，且除外高血壓等引起繼發性心肌肥厚的因素及其他心血管系統疾病。11例患者各家族中至少2人發病。

1.2研究方法對11例先證者進行基因篩查分析，如發現先證者基因突變異常，則進一步篩查其家系中其他成員。用鹽析法從患者外周血白細胞中提取基因組DNA，采用聚合酶鏈反應擴增基因。根據文獻設計MYH7基因第3～27號外顯子引物,由蘇州睿捷生物科技有限公司合成；其中第15號外顯子的引物上游序列為5′-AACACCCAACATGGCACCTC-3′，下游序列為5′-AGCAATTGACCTGGCTCAGAAC-3′。PCR擴增體系：25 μL反應體系含基因組DNA(50 ng/μL)1 μL，雙向引物(5 μmol/L)各1μL,10 mmol/L dNTP混合液 0.5 μL,50 mmol/L MgCl20.8 μL,10×PCR緩沖液 2.5 μL，DNA模板1 μL，DNA聚合酶0.2 μL(蘇州睿捷生物科技有限公司)，ddH2O 18 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min 1個循環，95 ℃變性30 s、57～60 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，35個循環，72 ℃終末延伸5 min 1個循環。PCR產物純化，ABI 3730XL測序儀分析結果。對測序結果異常的患者進行家系調查，進一步驗證。

2　結果

2.1基因篩查結果1例先證者發現MYH7基因的c.428G>A突變,導致該基因的第143位密碼子由CGG變為CAG，編碼的氨基酸由精氨酸變為谷氨酰胺(Arg143Gln)。見圖1。

2.2家系調查及臨床表型對上述MYH7基因突變家系的其他成員進行基因篩查及家系調查，發現該家系有2人攜帶突變基因。其中1人為先證者(Ⅰ-1)，男性，70歲，HCM病史7余年，平時常感活動后胸悶，心電圖示ST-T改變，心臟超聲示室間隔較厚處26～27mm，左房內徑(LAD)50 mm，左室舒張末期內徑(LVDD)50 mm，左室射血分數(LVEF)65%，左室流出道無梗阻。另1人為先證者小兒子(Ⅱ-3)，男性，40歲，平時無明顯不適，心電圖出現

注：上圖為正常野生型，箭頭處示正常堿基為G；下圖為雜合Arg143Gln突變型，箭頭處示突變位點。

圖1該家系MYH7基因4號外顯子測序圖

ST-T異常改變1年余，心臟超聲示室間隔最厚處達20 mm，LAD 42 mm，LVDD 43 mm，LVEF 71%，左室流出道無梗阻。先證者大兒子(Ⅱ-1)及先證者孫子(Ⅲ-1)、孫女(Ⅲ-2)均正常。見圖2。

圖2　攜帶MYH7基因c.428G>A突變家系圖

3　討論

MYH7是HCM致病基因中發病概率最高的基因，該基因位于染色體14q12，長23 kb，含40個外顯子，其38個外顯子編碼了1 935個氨基酸。其編碼的β-肌球蛋白重鏈是心肌肌球蛋白的主要成分，占肌球蛋白總量的95%以上。肌球蛋白分子由一形狀為長螺旋曲棒的桿部、兩個球狀頭部和頭桿結合部組成。MYH7基因中第3～21號外顯子形成其頭部，第21～25號外顯子形成其頸部(即頭桿結合部)，第25～40號外顯子構成其桿部[4]。自Jarcho等[5]發現HCM的第1個致病基因位于MYH7基因上，至今已發現MYH7基因存在190多種突變，大部分位于肌球蛋白頭部及頭桿結合部[6～9]。

本研究新發現的Arg143Gln突變位于肌球蛋白的頭部區域即S1，包括肌動蛋白結合位點、ATP酶活性位點及必需輕鏈(ELC)結合面[10]，是肌球蛋白的重要功能區域[11]。此前該突變已由國內外學者報道。2010年Kimura[12]認為該突變雖然造成了電荷變化(由帶正電荷的精氨酸突變為不帶電荷的谷氨酰胺)，但不在重要功能區域，70歲以上患者的存活率在93%以上，因此認為該突變位點為溫和性突變。2014年國內鐘海雷等[13]研究認為，該突變可能影響β-肌球蛋白二聚體形成，導致疾病發生，而該突變位點不在ATP酶活性區域，是一相對良性突變。本研究中該家系2人心肌肥厚程度偏重(先證者室間隔厚度達到27 mm，先證者的小兒子室間隔厚度為20 mm)，但癥狀少，病程進展慢，預后較好，總體情況與既往報道一致。但是也有某些研究與以上研究結果不同。邵春麗[14]認為攜帶Arg143Gln突變的患者均有黑朦或暈厥發作，屬于惡性突變，并且認為該突變是國內HCM人群的熱點突變。

本研究顯示，不同HCM患病人群中，即使基因突變位點相同，表型亦可不同，符合HCM遺傳異質性的特點；其他因素如修飾基因、環境因素、遺傳背景、突變導致的氨基酸極性以及親水性的改變等可能也在表型的形成過程中也起到一定的作用。下一步我們將就這些因素對表型的影響機制進行研究，以了解其在HCM表型發生、發展的作用。

[1] Maron BJ,Nichols PF,Pickle LW,et al.Patterns of inheritance in hypertrophic cardiomyopathy:assessment by M-mode and two-dimensional echocardiography[J]. Am J Cardiol,1984,53(8):1087-1094.

[2] Perrot A,Schmidt-Traub H,Hoffmann B,et al.Prevalence of cardiac beta-myosin heavy chain gene mutations in patients with hypertrophic cardiomyopathy[J].J Mol Med,2005,83(6):468-477.

[3] Seidman JG,Seidman C.The genetic basis for cardiomyopathy:from mutation identification to mechanistic paradigms[J].Cell,2001,104(4):557-567.

[4] Oldfors A.Hereditary myosin myopathies[J].Neuromuscul Disord,2007,17(5): 335-367.

[5] Jarcho JA,McKenna W,Pare JA,et al.Mapping a gene for familial hypertrophic cardiomyopathy to chromosome 14q1[J].N Engl J Med,1989,321(20):1372-1378.

[6] 萬文輝,吳恒芳,楊笛,等.中國肥厚型心肌病患者心肌肌鈣蛋白I基因突變類型的研究[J].中國臨床康復，2003，7(12):1806-1807.

[7] 吳恒芳,萬文輝,楊笛,等.中國人群肥厚型心肌病患者心肌肌鈣蛋白基因突變研究[J].中國臨床康復,2003,7(21):2897-2898.

[8] 宋雷,黃曉紅,惠汝太,等.心肌球蛋白重鏈基因Arg719Gln突變與家族性肥厚型心肌病[J].中華心血管病雜志,2001,29(6):348-352.

[9] 劉文玲, 謝文麗,胡大一,等.十個漢族家族性肥厚型心肌病MYH7、MYBPC3和TNNT2基因篩查結果及相應的臨床特征[J].中華心血管病雜志, 2006,34(3):202-207.

[10] 宋國杰.分子心臟病學[M].天津：天津科學技術出版社，2001:108-109.

[11] Schwartz K,Carrier L,Guicheney P,et al.Molecular basis of familial cardiomyopathies[J].Circulation,1995,91(2):532-540.

[12] Kimura A.Molecular basis of hereditary cardiomyopathy:abnormalities in calcium sensitivity,stretch response,stress response and beyond[J].J Hum Genet, 2010,55(2):81-90.

[13] 鐘海雷,李妍伸,杜彬彬,等.中國一肥厚型梗阻性肥厚性心肌病家系MYH7基因 Arg143Gln突變研究[J].中國優生優育,2014,20(3):137-140.

[14] 邵春麗.肥厚型心肌病的梗阻機制及基因型-表型的關聯研究[D].北京：北京協和醫學院,2010.

江蘇省蘇州市科技計劃項目(SYS201328)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.020

R542.2

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1002-266X(2016)33-0058-03

2015-10-04)