小鼠肺癌模型研究進展

胥孜杭 胡潔淼 陳曉 朱詩國

[摘要] 肺癌目前是世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤，并且肺也是惡性腫瘤最容易發生遠處轉移的器官之一。加大肺癌的科研力度勢在必行，建立合適的肺癌動物模型可為肺癌的發病原因、發病機制、預防策略及臨床早期診斷和藥物療效評價等提供研究基礎。其中，又因小鼠是科研中最常使用的實驗動物，故本文旨在介紹目前最常用的各種小鼠肺癌模型，如化學誘導小鼠模型、轉基因小鼠肺癌模型、異位移植小鼠模型、原位移植小鼠模型及小鼠肺轉移模型等構建方法，以及其在科研領域中的應用。分析表明，小鼠肺癌模型不僅需要多學科的交叉滲透以拓展其研究寬度，而且也需要將各種現有模型進行更靈活的運用和更深入的探索，這樣才能有所突破。

[關鍵詞] 肺癌；小鼠腫瘤模型；應用

[中圖分類號] R714.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0063-05

[Abstract] Currently， lung cancer is one of the most common malignant tumors， and it has the highest morbidity and mortality rate all over the world. Besides， lung is also the most prone to distal metastasis organs among a variety of malignant tumors. In this case， it is critical to put more effort in lung cancer research. Aproper animal lung cancer model provides research foundation on etiology， pathogenesis， prevention strategies， the early clinical diagnosis and efficacy evaluation research. Because mice are the most commonly used experimental animals in research， this paper introduced different methods and applications of mouse lung cancer models， such as chemical inducing model， transgenic mouse model， xenograft tumor model， orthotopic tumor model，and tumor metastatic model. According to previous reports， multidisciplinary research， versatility and in-depth exploration should be the focus to achieve breakthroughs in mouse lung cancer models.

[Key words] Lung cancer； Mouse tumor models； Application

世界腫瘤流行病學研究資料顯示，在我國肺癌的發病率和死亡率已躍居惡性腫瘤之首[1]。據《2012中國腫瘤登記年報》顯示，每年新發腫瘤312萬例，死亡超過200萬例，其中肺癌已取代肝癌，成為中國致死率最高的惡性腫瘤。由于肺毛細血管十分豐富，位于整個循環系統的中心環節，因此肺又是惡性腫瘤轉移最常見的器官，據頭頸部、乳腺、消化道、腎、睪丸、骨等肺外惡性腫瘤患者尸檢統計，其肺轉移比例可達20%～54%[2]，可見肺轉移是多種腫瘤的致死原因。而肺癌療效得不到提高的主要障礙在于其臨床表現復雜，難以早期發現，診斷時大部分患者已處于晚期失去有效治療的機會。為制訂出更有效的肺癌治療方法，加強科研力度是大勢所趨，其中模擬出與人類肺癌病因、發病機制、發展過程相似的動物模型又是重中之重。在科研實驗動物中，又因小鼠肺組織在形態、分子特征上與人類肺組織相近，且幾乎人類所有基因都可以在小鼠身上找到同源基因[3-4]；其次，小鼠繁殖周期短、生長快、飼養方便，并且近親繁殖的小鼠腫瘤發生率高，因此小鼠在腫瘤研究領域中被廣泛使用[5]。本文主要介紹目前最常用的小鼠肺癌模型的制備方法及其應用。

1 利用不同的方法建立小鼠肺癌模型

目前常用的肺癌小鼠模型有：化學誘導模型、異位移植模型、原位移植模型、轉基因模型、轉移模Z型等，下面對其分別進行闡述：

1.1 化學誘導肺癌模型

化學誘導模型是指通過使用化學致癌物，常用的如苯并芘、二乙基亞硝胺、3-甲基膽蒽苯等采用口服、吸入、腹腔注射、支氣管灌注或支氣管黏膜下注射等方法對小鼠進行誘癌。在此類模型中，自發肺腫瘤頻率最高的小鼠品系為A/J，而頻率最低的則為C57BL6/J[6]小鼠。

隨著流行病學對病因學調查資料的積累，化學誘癌取得了重大發展，為深入研究腫瘤形成機制提供條件。如建立小鼠被動吸煙模型，使用食物補充維生素E進行干預，發現維生素E可明顯改善由香煙煙霧提取物所抑制的小鼠胚肺細胞的增殖活性，及其導致的細胞DNA損傷、細胞凋亡和細胞周期發生改變情況等，還降低了肺腫瘤發病率，說明維生素E對此模型起到了化學預防作用[7]。此外，該模型還適用于中醫藥的抗肺癌研究，其用時較長的特點剛好符合“慢郎中”的中藥藥性，如使用中藥復方“陽和湯”連續給烏拉坦誘導的肺癌小鼠灌胃18周后，結果顯示在肺癌形成過程中“陽和湯”對超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）的活性及白細胞介素-2（IL-2）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達有回升作用，并能阻止與癌變相應的谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）活性及丙二醛（MDA）含量增高，可推遲腫瘤形成時間，降低腫瘤發生率[8]。該模型雖具有其優勢，但也存在一些問題，如成瘤時間長，通常需要數月，且誘發的腫瘤一般不能很好地發生轉移。

1.2 轉基因肺癌模型

轉基因肺癌小鼠模型就是應用基因工程技術，使小鼠體內包含有整合在基因組中的克隆DNA序列，使其能夠生產出將遺傳改變傳遞給后代的轉基因小鼠，以獲得帶有某種遺傳性疾病的小鼠模型。

有報道指出在小鼠肺腫瘤中有80%檢測出Kras突變[9]。故有研究者[10]利用重組腺病毒載體表達Cre重組酶誘導K-ras G12D在小鼠肺部表達，由K-ras G12D引起肺組織腫瘤的發生，從而建立小鼠肺腺癌模型，該模型可以模擬人類肺癌散發性特征，能更好地研究肺癌在早期階段的發生發展，然而使用腺病毒載體的誘發方式構建模型并不穩定，并且使用大量病毒誘發基因突變為瞬時過程，缺少了如間質沉積、局部浸潤及轉移等腫瘤進展期的特征。為了建立慢性自發肺部腫瘤的小鼠模型，我國有學者[11]利用SPC-CRE轉基因小鼠與LSL K-ras G12D轉基因小鼠雜交，構建一種肺組織特異性低表達Cre重組酶的SPC-CRE轉基因小鼠，并對7、9個月齡小鼠腫瘤結節進行檢測，證實獲得了SPC-CRE-Kras雙陽性轉基因小鼠，建立了從肺部炎性反應到肺腺瘤進展時程較長的慢性自發肺部腫瘤小鼠模型，為肺癌病因的研究提供了更長的窗口期。

轉基因小鼠肺癌模型對各期癌組織病變提供了相對足夠的時間，有利于病因學及發病過程的研究，并且該模型能夠條件控制基因的改變，使其在藥物開發過程中具有獨一無二的優勢，如Ohashi等[12]通過肺特異性表達活性蛋白C的病毒載體（SP-C/SV40），建立表皮生長因子受體特殊位點EG-FRde1748-752轉基因小鼠肺癌模型，發現表皮生長因子受體突變基因的活化可能是引起非小細胞肺癌對吉非替尼獲得性耐藥的機獨特制。但此模型的局限性在于建模時間難掌握、費用較高，數量上難以滿足實驗需求，且還要保證轉基因的相應產物（如異體抗原）不會對與腫瘤浸潤轉移相關的因素及藥物治療效果產生影響，故在實際應用上也受到一定限制。

1.3 異位移植模型

異位移植模型可分為皮下移植模型和腎被膜下移植模型，其中皮下移植是對肺癌進行實驗研究的首選方法，由于其操作簡單方便，通常只需將腫瘤細胞懸液或外科手術中采集的腫瘤組織移植到小鼠的背部、腋部、后肢等即可。曹慧慧等[13]將1×107個Lewis肺癌細胞注射于昆明種小鼠右腋皮下，觀察到模型組小鼠飲食量減少，體重增加緩慢，成瘤率及肺癌形成率均為68.75%，提示使用Lewis肺癌細胞可以建立昆明種小鼠肺癌模型。又如卓瑩等[14]在國內首次利用人新鮮完整肺癌組織塊移植于NOD/SCID小鼠右側前肢肩背部皮下，或經皮肺穿刺取得腫瘤小塊移植于BALB/c裸小鼠腎包膜下。各代移植瘤模型的組織病理學及免疫組化表型、表皮生長因子受體和K-Ras基因檢測均與來源肺癌組織相一致。其中腎包膜下移植是一種使用較少的移植方法，但由于腎包膜下血供豐富，又相對缺乏免疫防御機能，有利于提高移植腫瘤的成瘤率[15]，故通常利用此方法讓腫瘤成功生長，然后再將腫瘤傳代移植到小鼠皮下或原位進行研究。而對于瘤塊移植模型，一般來說原代移植成功率較低，一般需重復多次方可成功，耗時較長。

皮下移植模型為目前最常用的肺癌動物模型，其在新藥開發及藥物療效研究中有著舉足輕重的作用，如朱亞芳等[16]在C57BL/6小鼠皮下接種Lewis肺腺癌細胞，建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，觀察川芎嗪聯合順鉑對小鼠Lewis肺癌Mac2-結合蛋白（Mac2-BP）和血管內皮生長因子表達的影響。其次，又因皮下移植模型的腫瘤通常都接種于皮膚暴露部位，便于切除，故又有研究者利用此優勢研究藥物對肺癌原發瘤切除后腫瘤轉移的影響，如觀察中藥復方“十全大補湯”對Lewis肺癌小鼠原發瘤切除后轉移瘤的生長及血管生成的作用[17]。雖然皮下移植模型方便實用，但也存在局限性，如受到移植部位特異性的影響，皮下移植瘤的細胞生長脫離了原組織的微環境，導致實驗結果與臨床治療效果差異較大，并且皮下接種模型周期較長，且不易出現轉移，或常于未出現轉移時，負荷的腫瘤就已出現破潰，難以達到實驗要求等。

1.4 原位移植模型

原位移植的肺癌模型不僅有較高的腫瘤成瘤率，而且能突顯腫瘤的侵襲和轉移特性，從更大程度上模擬人體肺腫瘤的微環境，故該模型為目前較為理想的肺癌動物模型，常用的有以下幾種：

1.4.1 支氣管注射模型 Iochmann等[18]將標記有99Tcm的錫膠體（以便運用高分辨率影像定位觀測）的肺癌NCI-H209細胞與Matrigel基質膠的混懸液注射進小鼠的支氣管內，同時還皮下注射相同數量的細胞建立皮下模型，待11周后將小鼠全部處死，發現經支氣管注射的模型組小鼠的腫瘤經研磨后，其細胞的增殖活力以及一些微觀特征與實驗前的狀態幾乎無差別，且該模型的細支氣管被壓縮，肺泡被侵襲和破壞，在腫瘤中心還可見壞死組織以及大量的巨噬細胞浸潤，而皮下模型組均未出現這些現象。另有，張賀龍等[19]將肺癌細胞PC14/PE6及SBC-3/DOX直接注入小鼠氣管以建立細支氣管內的肺癌模型，并于注射后第42天將所有小鼠處死，觀察肺臟表面及解剖面均未發現腫瘤生長，將肺組織制做成病理切片，經HE染色后在光學顯微鏡下觀察，也未觀察到肺癌細胞生長，說明模型建立失敗，此提示經支氣管注射的肺癌模型較皮下模型而言雖更接近肺癌發生規律，但此方法操作困難、成瘤率低，其運用受到較大限制。

1.4.2 肺內注射模型 胥孜杭等[20]將穩定表達蟲螢光素酶的Lewis肺腺癌細胞與Matrigel按1∶1比例混勻后注射于C57 BL/6小鼠左肺，其特點是所需細胞數量少，5×104個即可成瘤，成功率達90%，且無需打開胸腔只需將左腋下皮膚剪一小口，并可利用活體成像技術監測到模型小鼠的腫瘤可轉移至對側胸廓、右肺、雙側腋下及腹股溝淋巴結等。隨著肺內注射法的技術越來越成熟，有研究者還構建了IDO過表達的小鼠Lewis肺癌細胞株，以建立肺癌原位模型，并通過活體成像及生存分析方法，觀察中藥復方“肺積方”和黃芪甲苷對肺癌小鼠的作用[21]。此外，利用肺內注射法還可研究腫瘤細胞轉移的生物學特征，如王菲等[22]對比Lewis肺癌細胞（LLC）及LLC原位接種后獲得的第一代衍生細胞（R1-LLC）和R1-LLC原位接種后獲得的第二代衍生細胞（R2-LLC）間的生物學特性，并比較該三種細胞在原位移植模型中的侵襲轉移能力，發現這三種細胞的增殖能力雖無明顯差別，但R2-LLC比R1-LLC及LLC細胞不論在體外還是體內實驗中都具有更強的侵襲及轉移能力。

1.4.3 胸腔注射模型 彭鵬等[23]在小鼠腋后線第6肋間胸腔或腋部皮下注射5×106個Lewis肺腺癌細胞，比較胸腔移植模型與皮下移植模型的區別，發現胸腔模型組小鼠生存期范圍離散程度較皮下模型組?。≒ < 0.05），病程中胸腔模型組小鼠體重下降、攝食減少等惡病質體征較皮下模型組明顯（P < 0.01），并且胸腔模型組還在早期就出現了胸水和腫瘤轉移，而皮下模型組中未發現。其中在胸腔移植模型中出現的消瘦、食欲不振、全身臟器不同程度損害等惡病質癥狀為腫瘤晚期特征。故有研究者[24]利用該模型觀察中藥復方“銀草合劑”對荷肺癌小鼠惡病質的影響，將肺癌H460細胞注射于小鼠胸腔內，以誘發惡病質，并于植入細胞后隔天灌服中藥“銀草合劑”，觀察小鼠惡病質改善情況。3周后發現對照組小鼠的攝食量、體重、三酰甘油、血糖、白蛋白皆下降，而在用藥組中則發現“銀草合劑”具有明顯提升白蛋白的功能（P < 0.05）。

1.5 轉移模型

由于腫瘤發生轉移是最重要的致死原因之一，而肺又為最常見的轉移灶，故構建小鼠肺轉移模型是解決臨床問題的基礎。

1.5.1 尾靜脈注射轉移模型 陳愉生等[25]將1×106個A549細胞注射入BALB/c小鼠尾靜脈，第5周出現鏡下肺部轉移結節，第11周開始出現肺部結構大量破壞，彌漫性的腫瘤細胞及淋巴結浸潤，病理證實為肺腺癌。通過尾靜脈建立的轉移模型可適用于多種腫瘤的轉移研究，比如乳腺癌最常見的轉移灶就為肺，龔宏霞等[26]用蟲熒光素酶標記的小鼠乳腺癌細胞4T1（4T1-luc），通過尾靜脈注射建立小鼠乳腺癌實驗性肺轉移模型。此外，肺轉移也常見于黑色素瘤，張永慈等[27]利用黑色素瘤細胞M21經尾靜脈接種于裸鼠，50 d內成瘤率達100%。除了這兩種肺轉移模型外，還有小鼠結腸癌細胞肺轉移模型[28]、小鼠骨肉瘤肺轉移模型[29]等，可見通過尾靜脈建立的肺轉移模型成功率高，轉移特性好，受到大家青睞。此外，該模型還常為新藥開發提供研究平臺，如涎腺腺樣囊性癌是比較常見的涎腺惡性腫瘤，雖生長緩慢，但易發生轉移，利用小鼠尾靜脈注射人涎腺腺樣囊性癌細胞（SACC-LM）1×106個/只，建立SACC-LM實驗性肺轉移模型，觀察新合成的可口服的精氨酸-天冬氨酸對該模型的作用[30]。雖然尾靜脈注射轉移模型已廣泛使用，但仍值得注意的是尾靜脈注射會迫使癌細胞集中于肺部毛細血管，使癌細胞從肺部溢出，導致過早出現轉移，這也是其應用的局限性所在。

1.5.2 骨髓注射肺轉移模型 Cutrera等[31]將5×104個腸癌細胞CT26注射入Balb/C小鼠右腿脛骨結節，經22 d后發現小鼠出現明顯肺部轉移，相同數量的細胞通過尾靜脈的方法注射進入小鼠體內也可出現肺轉移，但經皮下注射2×106個CT26細胞后卻未出現肺轉移情況，說明骨髓注射法所需更少的腫瘤細胞就可誘導遠端的肺部轉移。根據Fidler等[32]經典理論，腫瘤細胞的生長到發生轉移，要經歷細胞轉化、增殖，毛細血管新生，細胞入侵、進入血管，形成癌栓，然后經過血液循環至肺，著床，黏附血管，部分從血管溢出至肺實質組織，最終形成肺轉移瘤等多個步驟，其中尾靜脈注射是將腫瘤細胞直接注射進入血管中，相對于腫瘤的正常生理轉移情況來說，缺失了入侵血管前的一系列步驟，而骨髓注射具有入侵前環節，故相對來說經歷了更完整的轉移過程，更接近人類腫瘤發生肺轉移的情況，故此模型可用于肺癌發病機制的研究，但操作難度較大。

2 結語與展望

肺癌動物模型是對肺癌進行科學研究的重要手段和平臺，合適的動物模型對肺癌的發生機制、診斷及治療的研究具有十分重要的意義。而加強對肺癌的防治以降低其發生率和病死率是一個系統工程，需要預防醫學、影像學、病理學和臨床醫學等多學科的交叉滲透。如影像學在肺癌領域的應用，利用相位襯度成像技術，以微米尺度的空間分辨對從原位接種的肺癌小鼠取出的腫瘤組織進行成像，并定量分析，可重建清晰的三維模型，在此模型上還可發現小腫瘤結節的存在，該成果將有助于肺癌的早期診斷[33]。除了多學科的跨界合作以外，現有的肺癌小鼠模型也可靈活交叉、疊加應用，如在轉基因小鼠上再利用化學誘導法建立肺癌模型，不僅可深入了解興趣基因在肺癌中的作用機制還可研究化學致癌劑的誘癌機制。又如在肺癌研究中使用最多的異位移植模型，如今也有改良版本——腫瘤患者來源的移植瘤（patient-derived xenografts，PDXs）模型，即將各種患者來源的腫瘤組織移植到免疫缺陷或轉基因小鼠的恰當部位，有研究顯示使用此方法的荷瘤小鼠經過四代傳代后，其基因序列還可與原代腫瘤保持一致，說明該模型可更準確地模擬原發腫瘤[34]。所以小鼠肺癌模型的研究不僅需要多領域的跨學科合作以拓展其研究寬度，同時也需要將各種現有模型進行更靈活的運用及更深入的探索，這樣才能取得更大更快的突破。

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（收稿日期：2015-12-08 本文編輯：任 念）