黑尾近紅鲌精子活力研究

王貴英　李清　祝東梅　李佩　熊傳喜　劉文偉　陳見(jiàn)　孫艷紅

摘要：在水溫23 ℃的條件下，對(duì)黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）精子在不同濃度氯化鈉溶液、不同水體以及不同離體時(shí)間情況下的活力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，①在0～1.2%的氯化鈉溶液中，氯化鈉濃度小于0.5%時(shí)，隨著濃度的增加，黑尾近紅鲌精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨之延長(zhǎng)；在0.5%氯化鈉溶液中，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)（52.00±3.46 s），與其他組別差異顯著（P<0.05）；當(dāng)濃度大于0.9%時(shí)，精子未激活。②精子在蒸餾水中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（36.33±1.15 s）顯著（P<0.05）高于在自來(lái)水（32.00±1.00 s）和池塘水（27.67±1.52 s）中。③采用蒸餾水激活離體精子1～15 h，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，存活精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著差異（P>0.05），而精子成活率顯著降低（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）；精子活力；激活劑

中圖分類號(hào)：S965.123 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）08-2062-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.036

Abstract： The spermatozoa motility of Ancherythroculter nigrocauda in different concentrations of NaCl solution， different water bodies and different strorage time in vitro were investigated under the temperature of 23 ℃.The results showed as follows： ①In 0～1.2% NaCl solution， the rapid movement time of the sperm of A. nigrocauda tended to longer with the increase of NaCl concentration when it was less than 0.5%； the life span of the sperm of A. nigrocauda （52.00±3.46 s） was the longest at 0.5% NaCl solution， which had significant difference （P<0.05） with compared to other groups； When the NaCl concentration was higher than 0.9%， the initiation of the sperm of A. nigrocauda was inhibited.②The rapid movement time of the sperm of A. Nigrocauda in distilled water （36.33±1.15 s） was significantly （P<0.05） higher than that of tap water （32.00±1.00 s） and the pond water （27.67±1.52 s）.③Using distilled water to activate the sperm of A. Nigrocauda in vitro 1～15 h， the rapid movement time of the survival sperms had no significant difference （P>0.05） with the extension of time， while the survival rate of sperm significantly reduced （P<0.05）.

Key words： Ancherythroculter nigrocauda； sperm motility； activator

魚類精子是一類分化程度很高的細(xì)胞，在精巢中不活動(dòng)，一旦與其生存的水環(huán)境接觸，精子便立即被激活而開始運(yùn)動(dòng)。激活精子并影響精子活力的因素很多，如滲透壓、無(wú)機(jī)離子、酸堿度、水溫。對(duì)魚類精子而言，滲透壓的影響至關(guān)重要[1]，精子的部分能量就是消耗在滲透壓的調(diào)節(jié)上。Morisawa等[2]用不同滲透壓的氯化鈉、氯化鉀和甘露醇溶液進(jìn)行精子激活試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一些淡水硬骨魚類，如鯽（Carassius auratus）、褐三齒雅羅魚（Tribolodon hakonensis）的精子在高滲透壓溶液中不活動(dòng)，呈抑制狀態(tài)，若加入1滴去離子水，精子立刻被激活而運(yùn)動(dòng)，而用低滲透壓溶液去稀釋精子，同樣能誘發(fā)精子從抑制到激活狀態(tài)。王祖昆等[3]研究發(fā)現(xiàn)精子處于滲透壓偏高的溶液（大于270 mmol/L）中時(shí)，精子基本不活動(dòng)，即高滲溶液抑制精子，低滲溶液激活精子。當(dāng)溶液滲透壓超過(guò)500 mmol/L時(shí)，精子的激活將受到影響；當(dāng)溶液滲透壓低于200 mmol/L時(shí)，精子的抑制與激活反應(yīng)將逐步消失，淡水中激活后的精子將一直運(yùn)動(dòng)至死。羅明坤等[4]發(fā)現(xiàn)薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron）精子在2.5%～3.2%的鹽度范圍內(nèi)，薩羅羅非魚精子活力較強(qiáng)，其中以3.0%的鹽度時(shí)精子活力最高，激活率達(dá)90%。徐敏等[5]研究發(fā)現(xiàn)鹽度為4時(shí)，方正銀鯽[Carassius auratus gibelio（Bloch）]和大鱗鲃（Barbus capito）精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長(zhǎng)；鹽度為5時(shí)，松浦鏡鯉（Songpu mirror carp）精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長(zhǎng)；鹽度達(dá)到8以上時(shí)，3種魚的精子激活將受到抑制；鹽度大于10時(shí)，方正銀鯽和大鱗鲃精子死亡；鹽度大于11時(shí)，松浦鏡鯉精子死亡。精子活力是指精子群體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與壽命長(zhǎng)短，是反映精子質(zhì)量的重要指標(biāo)。精子活力評(píng)價(jià)是研究精子生理特性、精子受精、精子保存的基礎(chǔ)。魚類精子在良種選育、雜交育種、種質(zhì)保護(hù)及種質(zhì)改良等方面得到了廣泛應(yīng)用。

黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）俗名高肩、黑尾鲌，是鲌亞科魚類中生長(zhǎng)較快、味道鮮美的優(yōu)良品種，深受廣大養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的青睞。許多學(xué)者先后開展了黑尾近紅鲌肌肉成分、生物學(xué)、人工繁養(yǎng)技術(shù)等方面的研究，如譚德清等[6]評(píng)價(jià)了黑尾近紅鲌肌肉營(yíng)養(yǎng)成分；薛正楷等[7-9]研究了黑尾近紅鲌個(gè)體繁殖力、自然條件下的年齡與生長(zhǎng)、比例性狀、體長(zhǎng)與體重的關(guān)系；李清[10]研究了黑尾近紅鲌耗氧率與窒息點(diǎn)；王貴英等[11]、曹義虎等[12]研究了人工養(yǎng)殖條件下的黑尾近紅鲌生長(zhǎng)情況；丁立云等[13]初步研究了黑尾近紅鲌幼魚對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)需求；李偉東等[14]研究了黑尾近紅鲌飼料的適宜脂肪水平；白曉慧等[15]研究了不同年齡的黑尾近紅鲌消化酶活性。目前，關(guān)于黑尾近紅鲌精子活力研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為加速其育種進(jìn)程和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，精子生物學(xué)特性研究顯得尤為重要，本試驗(yàn)研究不同濃度氯化鈉溶液以及不同水體對(duì)黑尾近紅鲌精子活力的影響，旨在為其科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

黑尾近紅鲌取自武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司繁養(yǎng)基地，個(gè)體重0.6 kg左右，年齡為2冬齡，體質(zhì)健壯，體表光滑無(wú)傷。

1.2 激活劑的配制和采集

激活劑采用0～1.2%的氯化鈉溶液共13個(gè)濃度梯度，曝氣自來(lái)水取自于繁養(yǎng)基地，池塘水來(lái)自于繁養(yǎng)基地的小型水庫(kù)。

1.3 精子的采集與保存

采用DOM、LRH-A2、HCG等激素配伍對(duì)黑尾近紅鲌進(jìn)行催情后，將雄性黑尾近紅鲌捕起，用干毛巾擦干體表和泄殖孔，輕壓腹部取其精液，分別收集在潔凈干燥的試管中。要求精液呈乳白色，無(wú)血、無(wú)尿液、無(wú)糞便污染；精子采集以后，應(yīng)避免紫外線照射，盛有精液的試管置于放有冰塊的保溫瓶?jī)?nèi)備用。同時(shí)，試驗(yàn)樣品保持在試驗(yàn)過(guò)程中不被風(fēng)干。

1.4 精子活力觀察

根據(jù)精子群體在激活液中的運(yùn)動(dòng)狀況，不同的研究者將其分為不同的階段。通過(guò)對(duì)精子運(yùn)動(dòng)狀況的觀察來(lái)直接反映其活力情況，精子活力等級(jí)劃分參照吳景貴[16]的方法，將精子運(yùn)動(dòng)分為快速運(yùn)動(dòng)、中速運(yùn)動(dòng)、慢速運(yùn)動(dòng)、死亡，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間是從精液與試驗(yàn)溶液混合后70%的精子細(xì)胞轉(zhuǎn)化為中速運(yùn)動(dòng)的時(shí)間，視野中有95%的精子停止運(yùn)動(dòng)的時(shí)間為其壽命時(shí)間。

用吸管吸1滴試驗(yàn)溶液于載玻片上，然后用解剖針挑取少許新鮮精液置入載玻片的液滴中，立即在10×40倍顯微鏡下觀察精子被激活后的運(yùn)動(dòng)狀況，并統(tǒng)計(jì)所經(jīng)歷的時(shí)間，每尾魚鮮精連續(xù)觀察3次，取其平均值[17]。解剖針每次蘸取后要用擦拭紙擦干凈，以免對(duì)下組試驗(yàn)造成污染。精子活力觀察分為3個(gè)內(nèi)容：①不同濃度氯化鈉溶液對(duì)黑尾近紅鲌精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響，采用楊彩根等[18]、羅相忠等[19]的方法配制0～1.2% 13個(gè)濃度梯度的氯化鈉溶液，對(duì)精子進(jìn)行激活；②池塘水、自來(lái)水、蒸餾水對(duì)黑尾近紅鲌精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響；③采用蒸餾水激活，觀察離體精子1～15 h的活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Statistica 6.0軟件進(jìn)行分析，組間采用Duncans多重比較，進(jìn)行顯著性水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氯化鈉溶液對(duì)黑尾近紅鲌精子活力的影響

不同濃度氯化鈉溶液中，黑尾近紅鲌精子活力不同。由表1可見(jiàn)，在水溫23 ℃時(shí)，精子適宜的氯化鈉濃度為0.5%～0.6%。當(dāng)氯化鈉濃度為0.5%時(shí)，精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到最大值，為（52.00±3.46） s；氯化鈉濃度大于0.5%時(shí)，精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨濃度的上升而呈下降趨勢(shì)；氯化鈉濃度大于0.9%時(shí)，精子不能激活。通過(guò)對(duì)各組進(jìn)行單因素的顯著性檢驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.5%組與其他組均存在顯著性差異（P<0.05）。

2.2 池塘水、自來(lái)水、蒸餾水對(duì)黑尾近紅鲌精子活力的影響

由表2可見(jiàn)，水溫23 ℃時(shí)，黑尾近紅鲌精子在不同水體中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間不同，在池塘水、自來(lái)水和蒸餾水中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別是（27.67±1.52） s、（32.00±1.00） s、（36.33±1.15） s；黑尾近紅鲌精子在池塘水、自來(lái)水和蒸餾水中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間存在顯著性差異（P<0.05）。黑尾近紅鲌精子在蒸餾水中激活效果最好。

2.3 不同離體時(shí)間對(duì)黑尾近紅鲌精子活力的影響

由表3可見(jiàn)，采用蒸餾水激活，參照楊廣等[20]的方法對(duì)不同離體時(shí)間的黑尾近紅鲌精子進(jìn)行觀察，黑尾近紅鲌精子離體15 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，存活精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（28.67～31.67 s）無(wú)顯著變化（P>0.05），而精子成活率（15.67%～95.67%）顯著降低（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

觀察比較黑尾近紅鲌精子在池塘水、自來(lái)水、蒸餾水中的活力，以在蒸餾水中的運(yùn)動(dòng)效果最佳，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間為（36.33±1.15） s，這可能與不同水體的離子濃度、pH有關(guān)，或與不同水體的復(fù)雜成分引起。在實(shí)際生產(chǎn)中，精卵受精的稀釋液建議采用蒸餾水。

黑尾近紅鲌精子在不同濃度氯化鈉溶液中的活力不同，在0～0.5%的范圍內(nèi)，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨濃度的增加而延長(zhǎng)，以0.5%的濃度為最佳。氯化鈉濃度大于0.5%時(shí)，隨著濃度的增加，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸縮短；濃度大于0.9%時(shí)，黑尾近紅鲌精子不運(yùn)動(dòng)。本研究結(jié)果與楊彩根等[18]對(duì)黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）精子、魏開金等[21]對(duì)鰣魚（Macrura reevesi）精子、周定剛等[22]對(duì)黃鱔（Monopterus albus）精子、徐敏等[5]對(duì)松浦鏡鯉精子等研究結(jié)果是一致的；但與羅相忠等[19]對(duì)大口鲇（Silurus meridionlis）精子、羅明坤等[4]對(duì)薩羅羅非魚精子、陳春娜等[23]對(duì)達(dá)氏鱘精子等研究結(jié)果不同。造成這些差異的原因，主要與不同魚類精液的生理特性不同有關(guān)。

采用蒸餾水作為激活劑觀察不同離體時(shí)間的精子活力，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，存活的精子數(shù)越來(lái)越少；但只要精子是存活的，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間在各組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。這可能與精子在精液中的分布情況有關(guān)，精子從精巢排出后，精子的生存環(huán)境發(fā)生了改變，處于外圍的精子易受外界條件的變化而影響存活；也可能與激活劑自身的激活機(jī)制有關(guān)，以至于用同一種激活劑在不同的時(shí)間條件下激活時(shí)會(huì)造成運(yùn)動(dòng)時(shí)間的一致性。

精子在精液和精漿中是沒(méi)有活性的，只有當(dāng)外界條件給予激活時(shí)才表現(xiàn)出一定的活性。精子的運(yùn)動(dòng)主要靠尾部鞭毛的擺動(dòng)來(lái)進(jìn)行，能量由頂體來(lái)提供。精子鞭毛大多為9+2結(jié)構(gòu)，其外周的每對(duì)雙聯(lián)管中的亞管A含有動(dòng)力蛋白，動(dòng)力蛋白臂具有ATP酶活性，起著與橫紋肌球蛋白橫橋類似的機(jī)能作用。外界通過(guò)對(duì)cAMp-ATP-Mg2+系統(tǒng)的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)精子活力的控制。滲透壓是影響精子活力的主要因素。Morisawa等[2]發(fā)現(xiàn)淡水硬骨魚的精子可以被低于精漿滲透壓的溶液激活，而海水硬骨魚的精子可以被高于滲透壓的溶液激活。鹽類對(duì)精子活力具有調(diào)節(jié)作用，但是不同的鹽類其調(diào)節(jié)的具體機(jī)制不同。有的無(wú)機(jī)鹽表現(xiàn)出激活，有的卻表現(xiàn)出抑制。本研究中NaCl（特別是Na+）對(duì)黑尾近紅鲌精子在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出了明顯的激活傾向。NaCl在0～0.5%的濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)為逐漸激活；而濃度大于0.5%時(shí)，表現(xiàn)出抑制，在0.9%以上時(shí)黑尾近紅鲌精子就完全不動(dòng)了。因此，黑尾近紅鲌人工受精時(shí)，可選擇濃度為0.5%的NaCl溶液激活。

參考文獻(xiàn)：

[1] MARK C，BATES K，WILLIAM R. Effect of osmotic pressure on the activation and storage of channel catfish sperm[J].American Fisheries Society，1996，125：798-802.

[2] MORISAWA M，SUZUKJ K.Osmolajity and potsssium：Their roles in initiation of sperm motility in teleosts[J]. Science， 1980，210：1145-1146.

[3] 王祖昆，邱麟翔，陳魁候，等.我國(guó)南方主要淡水養(yǎng)殖魚類精子特性研究[J].淡水漁業(yè)，1985，15（1）：18-21.

[4] 羅明坤，趙 巖，THAMMARATSUNTOM J，等.pH、鹽度及K+、Ca2+和葡萄糖對(duì)薩羅羅非魚精子活力的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45（11）：2076-2080.

[5] 徐 敏，楊 建，姜海峰，等.NaCl鹽度和NaHCO3堿度對(duì)鯉、鯽和大鱗鲃的精子活力及其受精率的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2014，21（4）：720-728.

[6] 譚德清，王劍偉，但勝國(guó).黑尾近紅鲌含肉率及肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].水生生物學(xué)報(bào)，2004，28（3）：240-246.

[7] 薛正楷，何學(xué)福.黑尾近紅鲌個(gè)體繁殖力的研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，26（1）：90-94.

[8] 薛正楷，何學(xué)福.黑尾近紅鲌的年齡和生長(zhǎng)研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，26（6）：712-717.

[9] 薛正楷，何學(xué)福.黑尾近紅鮊的比例性狀、長(zhǎng)質(zhì)量關(guān)系和豐滿度[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，27（5）：811-815.

[10] 李 清.黑尾近紅鲌魚種耗氧率和窒息點(diǎn)的初步研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[11] 王貴英，張訓(xùn)蒲，李 清.黑尾近紅鲌?jiān)谌斯ゐB(yǎng)殖條件下的生長(zhǎng)[J].福建水產(chǎn)，2009，（1）：77-83.

[12] 曹義虎，馬保新，鄧勇輝，等.池塘養(yǎng)殖條件下黑尾近紅鲌0+～2齡的可量性狀研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（33）：20498-20500.

[13] 丁立云，曹義虎，周秋白，等.黑尾近紅鲌幼魚對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)需求的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：216-219.

[14] 李偉東，黃 峰，王貴英，等.飼料脂肪水平對(duì)黑尾近紅鲌生長(zhǎng)性能及魚體成分的影響[J].糧食與飼料工業(yè)，2014（11）：56-60.

[15] 白曉慧，王貴英，熊傳喜.不同年齡黑尾近紅鲌消化酶活性比較[J].淡水漁業(yè)，2007，37（3）：30-34.

[16] 吳景貴.鯉魚精子的壽命觀察報(bào)告[J].動(dòng)物學(xué)雜志，1959（10）：462-468.

[17] 舒 琥，黃 燕，張海發(fā)，等.鹽度及溫度對(duì)紅鰭笛鯛精子活力的影響[J].廣州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，4（2）：12-15.

[18] 楊彩根，宋學(xué)宏，王永玲.pH及不同濃度NaCl溶液對(duì)黃顙魚精子活力的影響[J].水利漁業(yè)，2003，23（3）：10-11.

[19] 羅相忠，周桂偉，潘光碧.大口鲇精子生理特性的研究[J].淡水漁業(yè)，2002，32（2）：51-53.

[20] 楊 廣，張 麗，肖立新.興國(guó)紅鯉精子在不同保存條件下的活力研究[J].淡水漁業(yè)，2003，33（6）：34-35.

[21] 魏開金，王漢平，林加敬，等.氯化鈉濃度對(duì)鰣魚精子活力影響的初步觀察[J].淡水漁業(yè)，1996，26（4）：9-10.

[22] 周定剛，溫安祥.黃鱔精子活力檢測(cè)和精子入卵早期過(guò)程觀察[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2003，27（5）：398-402.

[23] 陳春娜，黃穎穎，陳先均，等.達(dá)氏鱘精子的主要生物學(xué)特性[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2015，50（1）：75-87.