陸地棉棉酚合成關鍵基因杜松烯合酶基因克隆及序列差異分析

王志偉　張艷　薛薇　張桂寅

摘要：利用同源克隆法克隆獲得有酚陸地棉（Gossypium hirsutum）杜松烯合酶（Delta-cadinene sythase） 基因。結果表明，該基因長ORF為1 665 bp，編碼551個氨基酸，具有類戊二烯的保守結構域，有酚和低酚陸地棉之間，該基因存在序列差異。

關鍵詞：陸地棉（Gossypium hirsutum）；杜松烯合酶；克??；差異序列

中圖分類號：S562 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2114-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.051

Abstract： The gene named Delta-cadinene sythase in this study was obtained from using homology-based cloning method for cloning. The results showed that this gene contained an ORF of 1 665 bp in length encoding 551 amino acids with the conservative domain structure of class pentadiene.Between low phenol and phenolic G. hirsutum， the gene exist sequences of differences.

Key words： Gossypium hirsutum； Delta-cadinene sythase； clone； sequence of variance

棉花是重要的經濟作物，不僅是優質天然纖維的主要來源，而且種子中含有極為豐富的蛋白質。棉子蛋白是優質的蛋白質原料，可以提高動物生產性能，降低飼料成本[1]。中國每年有1 000萬t以上的棉子，年產棉子餅、粕達600萬t以上[2]。根據資料中國棉花棉子蛋白質含量為22%～24%[3]，是世界上僅次于大豆的重要植物蛋白質資源。目前全球大面積栽培的棉花品種主要是陸地棉（Gossypium hirsutum），其種仁含有棉酚及其衍生物，人及非反芻動物食用后會出現中毒現象，輕則頭暈、嘔吐，重則引起死亡。通過選育無腺體性狀已獲得無酚或低酚棉花品種，并已取得卓越成效，實踐證明采取控制腺體性狀來控制棉酚是很有效的策略[4]。然而從分子生物學角度，如何調控棉酚，探索棉酚與腺體之間的關系，達到有效控制棉酚和腺體，這都是亟待解決的問題。棉酚是倍半萜次生代謝物質，其生物合成代謝是異戊二烯途徑，其中倍半萜環化酶—杜松烯合酶（Delta-cadinene sythase）是該途徑的關鍵酶之一[5，6]。本研究擬采用同源克隆結合棉花D基因組序列克隆陸地棉參與棉酚合成的關鍵酶，為弄清棉酚與腺體形成的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

棉花幼苗采用無菌培養。精選大小均勻、無病蟲害的棉花種子，用0.1%的升汞消毒8 min，蒸餾水沖洗干凈，種植于裝有MS培養基的錐形瓶中。培養室溫度控制在晝溫25 ℃，夜溫20 ℃，光照周期12 h，光照度5 000 lx。

待棉花幼苗子葉完全展開時，選取生長健壯、大小均勻一致的植株進行取樣。稱取0.1 g用0.1% DEPC水沖洗干凈，在液氮中充分研磨后置于-70 ℃冰箱保存備用。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

取保存的樣品，采用EASYspin RNA快速提取試劑盒（重慶波爾公司）提取總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。采用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠（1.2%）電泳檢測RNA的質量。采用ReverTra Are qPCR RT Master Mix with gDNA Remover （TOYOBO）試劑盒，按照試劑盒說明書操作合成第一鏈cDNA，用于基因克隆。

1.3 種子序列及基因全長的獲得

1）利用已經發表的其他物種上相關基因的序列，采用Blast程序在NCBI網站進行棉花EST數據庫比對，尋找出高度同源的序列，將同源序列進行拼接組裝成重疊群（Contig）。

2）以重疊群為種子序列，再次Blast檢索棉花的EST數據庫和序列組裝，延伸重疊序列，重復上述過程，直至沒有新的EST檢出即重疊群序列不再延伸，從而生成最終的最長新生序列。將新獲得的種子序列與公共數據庫棉花D基因組比對，找到該序列對應的基因全長，以該全長序列為參考設計引物，以陸地棉cDNA為模版擴增，并通過測序獲得目的基因全長序列。

1.4 目的基因的PCR擴增

以上述反轉錄得到的棉花cDNA為模版，進行PCR擴增。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸105 s，23個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR 擴增目的條帶回收純化后pMD18-T載體連接并轉化到大腸桿菌TOP10，挑取陽性克隆、提取質粒，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 目的基因的生物信息學分析

通過 NCBI 的ORF finder尋找杜松烯合酶基因的開放讀碼框，通過Blast和CDD 數據庫分析氨基酸序列和結構域；通過ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析蛋白質的等電點、相對分子質量等理化性質；利用SignalP3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）進行信號肽分析；在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和中國農業科學院棉花研究所棉花基因組數據庫（http：//cgp.genomics.org.cn/page/cn/index.jsp）中Blast杜松烯合酶基因的同源基因，并進行序列比對分析。

2 結果與分析

2.1 RNA提取與cDNA的合成

對提取的RNA進行1.2%的瓊脂糖電泳檢測，上樣量為1 μL，從圖1中可以看出，28 s RNA、18 s RNA特征譜帶無拖尾現象，比例約為2∶1，RNA完整，無降解，質量高，符合試驗要求。反轉錄cDNA主要集中在250～1 500 bp（圖2），說明質量較好，可用于后續試驗。

2.2 杜松烯合酶全序列的克隆

基于cDNA全序列設計引物，PCR擴增后獲得了1 851 bp的目的片段（圖3），其中包括1 665 bp的開放讀碼框（ORF），29 bp的5UTR和157 bp的3UTR。經測序分析該全序列與拼接序列完全相同，其中包括1 665 bp的ORF區域。

2.3 杜松烯合酶氨基酸序列及保守結構域分析

生物信息學分析表明，該基因編碼551個氨基酸殘基（圖4），具有類戊二烯的保守結構域，表明克隆得到的序列為杜松烯合酶基因序列。

2.4 杜松烯合酶基因的生物信息學分析

通過在線ProtParam分析杜松烯合酶蛋白質的理化性質，推測其分子式為C2865H4413N759O860S24，相對分子質量約為64 ku，理論等電點（pI）為5.3。SignalP3.0信號肽分析顯示該基因內部沒有信號肽，如圖5所示。

2.5 有酚與低酚陸地棉種杜松烯合酶基因的序列差異比較

將克隆得到的杜松烯合酶基因與數據庫中來自于低酚陸地棉的該基因（U88318.1）進行序列比較，發現2個基因存在序列差異，如圖6所示。推測這些序列內部的差異位點對有酚和無酚棉種基因功能具有重要作用。

3 小結與討論

由于棉子只是棉花生產的副產品，長期以來，棉花育種圍繞棉纖維產量和品質展開。開展棉子營養品質的研究與改良還很有限，加上常規育種存在檢測成本高及檢測效率低等不足，利用基因工程手段結合常規育種可以對棉子品質改良帶來更廣闊的前景[7]。

本研究通過同源克隆法獲得了有酚陸地棉棉酚合成酶關鍵基因—杜松烯合酶基因的cDNA全序列，通過Blast分析發現該基因編碼一個含有551氨基酸殘基的多肽，保守結構域分析顯示其具有類戊二烯的保守結構域。有酚與低酚陸地棉中序列差異比對發現，杜松烯合酶基因在二者間具有高度的同源性（99.16%），但也存在序列間的多態性，這些位點的變異可能是導致2個棉花品種在棉酚合成方面的不同。

參考文獻：

[1] BLACKWELDER J T，HOPKINS B A，DIAZ D E，et al. Milk production and piasma gossypol of cows fed cottonseed and oilseed meals with or without rumen-undegradadle protein[J]. Journal of Dairy Science，1998，81：2934-2941.

[2] 李愛科，郝淑紅，伍松陵.植物蛋白質飼料資源開發利用新技術研究進展[J].飼料與畜牧，2006（10）：5-9.

[3] 邱新棉.試論低酚棉資源及其利用前景[J].中國棉花，2000，27（2）：7-9.

[4] 夏正俊，顧本康，吳藹民，等.棉花品種抗黃萎病性與體內生化成分相關分析[J].植物保護學報，1994，21（4）：305-310.

[5] 許智宏，陳曉亞.植物生物技術原理-植物次生代謝途徑及其調控[M].北京：科學出版社，1998.

[6] 余敘文，陳曉亞.植物生理與分子生物學[M].北京：科學出版社，1999.

[7] 朱乾浩，俞碧霞，許馥華.低酚棉棉籽品質性狀的遺傳分析[J].棉花學報，1995，7（2）：94-99.