美滿霉素對阿爾茨海默病大鼠認知損傷及海馬BDNF、Bcl-2和Bax表達的影響

孫縵利，鄧海峰，李明華，劉國良，常全忠

美滿霉素對阿爾茨海默病大鼠認知損傷及海馬BDNF、Bcl-2和Bax表達的影響

孫縵利，鄧海峰，李明華，劉國良，常全忠△

目的觀察美滿霉素對阿爾茨海默病（AD）大鼠認知功能和海馬腦源性神經營養因子（BDNF）、凋亡相關因子Bcl-2和Bax表達的影響，探討美滿霉素對AD大鼠腦保護作用的機制。方法側腦室注射Aβ25-35建立AD大鼠模型。30只健康雄性SD大鼠隨機分成對照組、模型組和治療組，每組10只。對照組和模型組腹腔內注射生理鹽水1 mL/（kg·d），治療組腹腔注射美滿霉素50 mg/（kg·d），均持續14 d。Morris水迷宮檢測行為學變化，蛋白免疫印跡（Western blotting）法和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表達，原位末端標記（TUNEL）法檢測海馬神經元凋亡率。結果美滿霉素可以明顯提高AD大鼠學習記憶能力，上調AD大鼠海馬BDNF、Bcl-2表達，下調Bax表達，減少海馬神經元凋亡。結論美滿美素可以通過促進神經元的生長、抑制神經元的凋亡發揮腦保護作用。

四環素類；阿爾茨海默病；細胞凋亡；神經組織蛋白質類；認知；美滿霉素；腦源性神經營養因子

阿爾茨海默病（AD）是一種中樞神經系統退行性疾病，主要表現為漸進性記憶、認知障礙等癥狀［1］，隨著發病率不斷上升，嚴重威脅著人類健康和社會發展。AD的發病機制目前還不清楚，有研究報道腦源性神經營養因子（BDNF）、凋亡相關因子Bcl-2和Bax與AD的發病機制有關［2-3］。美滿霉素是一種半合成的第2代四環素衍生物，容易透過血腦屏障到達中樞神經系統［4］。研究表明，美滿霉素可以通過抑制星型膠質細胞的激活、神經炎癥、氧化應激等途徑改善癡呆大鼠的認知障礙［5-6］。然而，美滿霉素是否可以通過調節BDNF、Bcl-2和Bax的表達來改善AD大鼠的認知障礙，發揮腦保護作用，目前報道甚少。本課題組擬通過觀察側腦室注射β淀粉樣肽25-35（Aβ25-35）誘導的AD大鼠的認知和海馬BDNF、Bcl-2和Bax的表達變化，探討美滿霉素對AD大鼠的腦保護作用機制，以期為臨床治療AD提供新思路和實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料Morris水迷宮裝置（中國醫學科學院藥物研究所研制）；DW-5大鼠腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司）；美滿霉素膠囊（100 mg/粒，中國惠氏制藥有限公司）；青霉素（哈藥集團）；BDNF、Bcl-2和Bax酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（鄭州森斯科貿有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠BDNF、Bcl-2和Bax多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、Aβ25-35、戊巴比妥鈉均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組30只健康雄性SD大鼠，清潔級，體質量（250±10）g，購自河南省實驗動物中心（動物合格證編號：SCXK豫2013-0002），所有動物都在自然光暗周期的環境中飼養，自由覓食、飲水。隨機數字表法分成對照組、模型組和治療組，每組10只。

1.2.2AD模型的制備用二甲基亞砜50 μL溶解0.1 mg Aβ25-35，再用0.1 mol/L PBS 50 μL稀釋成10 g/L的溶液，置于37℃溫箱孵育72 h，觀察其呈現明顯絮狀，孵育完成，4℃冰箱保存備用。實驗動物常規飼養2周后，用0.8%戊巴比妥鈉（10μL/g，腹腔注射）麻醉，固定于腦立體定位儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點，向后1.5 mm，旁開1.2 mm為穿刺點，顱鉆穿孔，自顱骨表面進針3.5 mm至側腦室，用微量注射泵將2 μL凝聚態Aβ25-35在5 min內緩慢注入，留針5 min，以使Aβ25-35充分浸潤局部組織，退針后縫合傷口。對照組給予2 μL生理鹽水。術后給予青霉素（4×106U/kg）肌內注射，傷口處碘伏消毒，1次/d，共5 d。術后對照組和模型組腹腔內注射生理鹽水1 mL/（kg·d），治療組腹腔注射美滿霉素50 mg/（kg·d），均持續14 d，給藥劑量參照文獻［5］。

1.2.3行為學檢測各組大鼠的學習記憶能力Morris水迷宮水池中加入適量的墨汁，使水池成為不透明色（去除視覺干擾），水溫保持在22～23℃。將大鼠面向池壁放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為逃避潛伏期，歷時5 d。5 d后去除平臺，測其第1次到達原平臺位置的時間、120 s內穿環次數。

1.2.4蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達0.8%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經4%多聚甲醛心臟灌流，快速取出全腦，冰浴分離出大鼠前額葉皮質，按10 mL/g的比例加入全細胞裂解液，組織經勻漿、超聲破碎后，用BCA法進行蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉NC膜。雜交步驟如下：10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，TBST（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；0.15 mmol/L NaCl；0.05%Tween 20）漂洗3次，每次10 min，然后室溫下與兔抗鼠一抗BDNF（1∶500）、Bcl-2（1∶200）、Bax（1∶200）雜交反應2 h，TBST漂洗同前。再將NC膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG（1∶2 000）雜交反應1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入ECL試劑反應5 min，保鮮膜包裹，暗室進行X線膠片曝光、顯影和定影。然后同一張NC膜再與β-actin（1∶1 000）進行雜交反應。Western印跡條帶經凝膠成像分析系統掃描處理，計算單位光密度值和條帶面積，將各實驗點的總光密度值與對照組比較，得到相對百分數。

1.2.5ELISA法檢測各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達0.8%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經4%多聚甲醛心臟灌流，快速取出全腦，冰浴分離出大鼠前額葉皮質，1∶10勻漿，4℃，10 000 r/min，離心10 min，取上清液。實驗嚴格按照說明書步驟進行。

1.2.6原位末端標記（TUNEL）法檢測各組大鼠海馬神經元凋亡率嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明書提供的方法進行，所有切片染色均采用相同的條件，每批染色均設陰性對照。陰性對照滴加PBS代替TUNEL反應混合物孵育切片，結果為陰性。

1.3統計學方法統計學處理用SPSS 19.0軟件包，實驗數據用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1美滿霉素對大鼠學習記憶能力的影響與對照組相比，模型組大鼠平均逃避潛伏期和第1次到達原平臺位置的時間明顯延長（P＜0.05），穿環次數明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，治療組大鼠平均逃避潛伏期和第1次到達原平臺位置的時間明顯縮短（P＜0.05），穿環次數明顯增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1Effects of minocycline on the cognition in three groups表1　美滿霉素對各組大鼠學習記憶能力的影響（n=10，）

Tab.1Effects of minocycline on the cognition in three groups表1　美滿霉素對各組大鼠學習記憶能力的影響（n=10，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組治療組F逃避潛伏期（s）50.24±9.57 89.56±12.38a 57.23±10.14b 37.97＊＊第1次到達原平臺位置的時間（s）7.54±1.98 16.63±4.19a 9.58±2.70b 23.72＊＊穿環次數6.52±1.04 2.61±0.85a 5.25±1.36b 32.67＊＊

Tab.2Expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of three groups表2　各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表達（n=10，ng/L，）

Tab.2Expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of three groups表2　各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白的表達（n=10，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組治療組F Bax 28.62±5.29 87.35±11.53a 49.13±9.62b 105.15＊＊BDNF 38.60±6.46 12.14±3.28a 24.07±4.59b 71.62＊＊Bcl-2 34.27±6.53 13.60±3.42a 21.32±4.16b 45.68＊＊

2.2美滿霉素對各組大鼠海馬BDNF、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

2.2.1Western blotting法檢測結果模型組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達量低于對照組（P＜0.05），而Bax蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。與模型組相比，治療組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達量均顯著上調（P＜0.05），而Bax蛋白表達量顯著下調（P＜0.05），見圖1。

2.2.2ELISA法檢測結果與對照組相比，模型組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），而Bax蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，治療組大鼠海馬BDNF和Bcl-2蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），而Bax蛋白表達顯著下降（P＜0.05），見表2。

2.3美滿霉素對各組大鼠海馬神經元凋亡的影響TUNEL法檢測結果顯示，3組間海馬神經元凋亡率差異有統計學意義（F=106.22，P＜0.01）。與對照組（6.47±3.28）%相比，模型組大鼠海馬神經元凋亡率（43.26±7.73）%顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組海馬神經元凋亡率（22.68±5.05）%明顯減少，但高于對照組（P＜0.05）。

3　討論

AD的主要病理特征是神經元的丟失，而細胞凋亡在AD患者神經元的丟失中扮演重要角色，與AD的發生、發展關系密切，而且在大腦皮質和海馬區的神經元丟失更加明顯［7-8］。AD神經元凋亡機制復雜，目前尚無定論。因此，進一步研究AD神經元凋亡機制并采取一定的措施干預神經元的凋亡可以為防治AD提供一定的幫助。Bcl-2家族蛋白是所有細胞凋亡通路中的下游蛋白，Bcl-2家族成員包括Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Bad等［9］，當Bcl-2表達增加可抑制凋亡，而Bax表達增加可促進凋亡，Bcl-2/Bax比值通常被認為是反映細胞是否凋亡的重要指標［10］。BDNF是神經生長因子的家族成員之一，在中樞和外周均廣泛存在，對神經元的存活、再生、修復和誘導分化具有重要作用［11-13］。因其主要在海馬和皮質表達，而海馬涉及了學習和記憶、執行、注意等認知功能［14］，這提示BDNF可能與認知功能有關。

基于以上研究和假設，本課題組通過側腦室注射Aβ25-35建立AD大鼠模型，采用行為學結合分子生物學的手段，觀察美滿霉素對AD大鼠海馬區BDNF、Bcl-2和Bax表達的影響。實驗結果發現，美滿霉素可以明顯改善AD大鼠的認知能力，上調AD大鼠海馬BDNF、Bcl-2的表達，下調Bax的表達，降低神經元凋亡率，提示美滿霉素可能通過促進神經元的生長、抑制神經元的凋亡，改善AD的認知功能，發揮腦保護作用。

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（2016-01-22收稿2016-05-22修回）

（本文編輯魏杰）

Effects of minocycline on the cognition and expression of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus of Alzheimer's disease model rats

SUN Manli，DENG Haifeng，LI Minghua，LIU Guoliang，CHANG Quanzhong△
School of Basic Medical Sciences，Luohe Medical College，Luohe 462000，China△

E-mail：cqzchang@tom.com

ObjectiveTo investigate the effect of minocycline on the cognition and expressions of brain-derived neurotrophic factor（BDNF），apoptosis related factor Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats with Alzheimer's disease（AD）.MethodsThe rat model was established by microinjection of Aβ25-35into lateral ventricle.Thirty healthy male SD rats were randomly divided into three groups:control group，model group and minocycline treatment group.Normal saline 1 mL/（kg·d）was intraperitoneally injected in control group and model group.The minocycline treatment group was intraperitoneally injected with minocycline 50 mg/（kg·d）for 14 days.Morris water maze was used to detect the behaviors of animals.The expressions of BDNF，Bcl-2 and Bax in hippocampus were measured by Western blotting and enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The apoptosis of neurons was detected by TdT-mediated dUTP nick-end labeling（TUNEL）.Results Minocycline greatly improved the behaviors of AD rats，up-regulated the expressions of BDNF and Bcl-2，and downregulated the expression of Bax in hippocampus，and reduced cell apoptosis.ConclusionMinocycline plays a protective role in neural function by promoting the growth of neurons and inhibiting the neuronal apoptosis.

Tetracyclines；Alzheimer disease；apoptosis；nerve tissue proteins；cognition；Minocycline；brain-derived neurotrophic factor

R741

A

10.11958/20160028

漯河醫學高等專科學校2015年度基礎科學重點研究項目（2015-S-LMC06）；2015年度河南省科技廳基礎與前沿技術研究（152300410014）；2014年度河南省科技廳自然科學項目資助（142300410431）

漯河醫學高等專科學校基礎醫學部（郵編462000）

孫縵利（1987），女，講師，碩士，主要從事腦認知功能的研究

E-mail:cqzchang@tom.com