響應面法優化酶法提取馬鮫魚油

黃惠莉, 童記強, 汪泳, 馬赫

(1. 華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021;2. 惠安瑞芳食品有限公司, 福建 泉州 362131)

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響應面法優化酶法提取馬鮫魚油

黃惠莉1, 童記強1, 汪泳2, 馬赫1

(1. 華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021;2. 惠安瑞芳食品有限公司, 福建 泉州 362131)

為了提高馬鮫魚的綜合利用價值，采用單因素實驗和響應面優化實驗對馬鮫魚下腳料中魚油的提取工藝進行研究，并對其脂肪酸組成進行分析.結果表明：馬鮫魚油提取的適宜工藝條件是pH值為7，中性蛋白酶加酶量為1.5%，酶解時間為3 h，液固比為3∶1，酶解溫度為52 ℃，馬鮫魚油提取率為75.38%.對馬鮫魚油的脂肪酸進行分析，共檢出12種脂肪酸，其中，不飽和脂肪酸質量分數為54.13%，二十碳五烯酸(EPA)質量分數為8.40%，二十二碳六烯酸(DHA)質量分數為7.06%，EPA和DHA的質量分數較高.

馬鮫魚油； 酶解; 脂肪酸; 響應面法

馬鮫魚(Scomberomorusniphonius)體內含有較多的脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸和蛋白.常食可增強機體免疫力[1].目前，馬鮫魚的利用主要在凍品、鮮銷,以及制備馬鮫魚卷或其他魚食品方面[2].在馬鮫魚制品的加工過程中，下腳料廢棄較多，充分開發這些下腳料有利于提高馬鮫魚的附加值.近年來，關于魚類油脂提取工藝的研究較多[3-6]，但利用馬鮫魚下腳料提取魚油的研究較少[7].目前，魚油的提取方法主要有壓榨法、溶劑法、蒸煮法、淡堿水解法、酶解法與超臨界流體萃取法等[5,8-9].酶解法是利用蛋白酶對蛋白質的水解，破壞蛋白質和魚油的結合關系，從而釋放出魚油.酶解法提取魚油工藝條件溫和，提取出的魚油品質好，且蛋白質水解液可以再利用.本文通過酶法水解馬鮫魚下腳料，通過響應面法優化酶法水解工藝，并測定其脂肪酸組成.

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

1.1.1實驗原料將馬鮫魚下腳料(主要為魚皮和魚骨，福建省泉州市惠安瑞芳食品有限公司)于-20 ℃的冰箱冷凍，再將其切碎，貯藏備用.

1.1.2實驗藥品木瓜蛋白酶(酶活333.4 kat·g-1)、風味蛋白酶(酶活6.668 kat·g-1)、中性蛋白酶(酶活66.68 kat·g-1)、堿性蛋白酶(酶活6.668 kat·g-1)、動物蛋白酶(酶活0.25 kat·g-1)均由南寧龐博生物工程有限公司提供；石油醚(沸點60～90 ℃)、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醇、硫酸、正己烷(分析純)均由上海國藥集團化學試劑有限公司提供.

1.1.3實驗儀器與設備SXT-02型索氏提取器(上海洪紀儀器設備有限公司)；ME204E型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；PK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；HJ-4A型數顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市醫療儀器廠)；pH 700型臺式pH計(美國優特公司)；TG16-WS型臺式高速冷凍離心機(長沙市湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；GCMC-QP 2010 Plus型氣相質譜聯用儀(日本島津公司).

1.2實驗方法

1.2.1馬鮫魚下腳料基本成分的測定水分測定采用常壓干燥法，參照國家標準GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》；粗蛋白質測定采用凱氏定氮法，參照國家標準GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》；粗脂肪測定采用索氏提取法，參照國家標準GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》；灰分測定可采用灼燒法，參照國家標準GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》.

1.2.2酶法提取馬鮫魚油工藝稱取25 g 馬鮫魚下腳料，放入250 mL燒杯中，加一定量的水，調節pH值，加入一定量的蛋白酶，控制攪拌速度為400 r·min-1，在一定溫度條件下，酶解一定時間.酶解完成后，在8 000 r·min-1的條件下，離心10 min，分離出上層液，即為馬鮫魚油.最后稱量，計算提取率，提取率的計算式為

式中：w為馬鮫魚下腳料的粗脂肪質量分數.

1.2.3單因素實驗根據實驗結果，選擇蛋白酶種類、pH值、溫度、液固比、加酶量、酶解時間作為單因素，以魚油提取率為評價參數，確定酶法提取馬鮫魚油的工藝范圍.

1.2.4響應面優化實驗根據單因素實驗的結果，選取加酶量(ψ)、酶解時間(t)、液固比、酶解溫度(θ)等4個影響因素為自變量，以魚油提取率作為響應值，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，運用Design Expert 8.0進行響應面設計.+1，0，-1分別代表4因素的高、中、低水平，設計響應面實驗因素水平，如表1所示.

表1　響應面實驗因素水平表

1.2.5氣質聯用測脂肪酸組成[10]取2滴樣品于10 mL試管，加0.5 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液1.0 mL，搖勻，在60 ℃水浴中反應30 min.取出冷卻至室溫，加入3 mL質量分數為14%的硫酸-甲醇溶液，搖勻，60 ℃水浴加熱5 min，冷卻至室溫，加入3 mL正己烷提取上層溶液用于氣相色譜分析.

色譜柱為Rtx-5Ms，載氣為高純氦，進樣溫度為260 ℃，柱流量為2.05 mL·min-1，分流比為30∶1.程序升溫條件為120 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升溫到200 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1升溫到240 ℃，保持5 min.電離方式為電子轟擊電離(EI)，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，質荷比為45.00～400.00 m·z-1，檢測器電壓為1 kV.

2　結果與討論

2.1馬鮫魚下腳料基本成分

經檢測，馬鮫魚下腳料中粗蛋白質量分數為22.76%，粗脂肪質量分數為7.22%，可作為提取油脂的良好原料.

圖1　不同蛋白酶對馬鮫魚油提取率的影響Fig.1　Effect of different kinds of protease on extraction rate of spanish mackerel oil

2.2單因素實驗

2.2.1不同蛋白酶對馬鮫魚油提取率的影響在加酶量為馬鮫魚下腳料質量的0.2%，酶解時間為3 h， 液固比為1∶1，以及酶最適pH值和溫度的條件下進行酶解.不同蛋白酶對馬鮫魚油提取率(δ)的影響，如圖1所示.

由圖1可知：木瓜蛋白酶得到的魚油提取率最高，約73%；其次為堿性蛋白酶和中性蛋白酶.雖然木瓜蛋白酶的提取率最高，但木瓜蛋白酶的價格是中性蛋白酶價格的兩倍，因此，對工業生產而言不是很經濟.而中性蛋白酶是在pH值為7的條件下，在水體系下的pH值約為7，無需加其他物質調節pH值，這適用于于工業生產.因此，實驗采用中性蛋白酶提取馬鮫魚油.

2.2.2pH值對馬鮫魚油提取率的影響在酶解溫度為50 ℃，液固比為1∶1，加酶量為馬鮫魚下腳料質量的0.2%，酶解時間為1 h，pH值分別為5,6,7,8,9的條件下進行實驗，考察pH值對魚油提取率的影響，結果如圖2所示.

由圖2可知：隨著pH值的升高，魚油提取率上升；當pH值超過8，魚油提取率下降.這是因為酶在特定條件下都有最適pH值，pH值過高或過低都會導致酶的活性降低，甚至失活[11].由于pH值在6～8時魚油提取率變化不大，因此，在條件優化時，忽略pH值這個單因素.

2.2.3酶解溫度對馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7,液固比為1∶1,加酶量為馬鮫魚下腳料質量的0.2%,酶解時間為1 h，酶解溫度分別為20，30，40，50，60 ℃的條件下進行實驗，考察酶解溫度對魚油提取率的影響，結果如圖3所示.

由圖3可知：隨著酶解溫度的升高，魚油提取率逐漸升高；當酶解溫度為50 ℃時，提取率最高；當酶解溫度超過50 ℃時，提取率反而下降.這是因為溫度的升高有助于提高分子熱運動，使酶能更好地與底物結合[12].溫度過高，魚油的顏色也會加深，影響魚油品質.因此，最適酶解溫度選擇50 ℃.

圖2　pH值對馬鮫魚油提取率的影響 圖3　酶解溫度對馬鮫魚油提取率的影響　　　　Fig.2　Effect of pH on extraction Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on 　　　　　rate of spanish mackerel oil extraction rate of spanish mackerel oil

2.2.4液固比對馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7，酶解溫度為50 ℃，加酶量為馬鮫魚下腳料質量的0.2%，酶解時間為1 h，液固比分別為1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1的條件下進行實驗，考察液固比對魚油提取率的影響，結果如圖4所示.

由圖4可知：隨著液固比的增加，魚油提取率逐漸上升；當液固比上升到2∶1時，提取率最高；當液固比繼續升高，魚油提取率反而下降.在反應體系中，當水的質量分數較低時，酶在反應體系中分布不均，不能很好地與底物接觸[13];當水的質量分數過高時，酶的相對濃度降低，使酶和底物接觸減少，魚油提取率會下降.因此，最適的液固比選擇2∶1.

2.2.5加酶量對馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7，酶解溫度為50 ℃，液固比為2∶1，酶解時間為1 h，加酶量為馬鮫魚下腳料質量的0%，0.2%，0.5%，1%，3%的條件下進行實驗，考察加酶量對魚油提取率的影響，結果如圖5所示.

圖4　液固比對馬鮫魚油提取率的影響 圖5　加酶量對馬鮫魚油提取率的影響　　Fig.4　Effect of liquid to solid ratio on 　 Fig.5　Effect of enzyme dosage on extraction　vextraction rate of spanish mackerel oil 　rate of spanish mackerel oil

由圖5可知：隨著加酶量的增加，魚油提取率也升高；當加酶量達到1%后，繼續增加酶的質量分數，魚油提取率沒有明顯變化，有少量下降.隨著酶質量分數的增加，更多的蛋白質被降解，被釋放的脂肪質量分數也隨之增加[14].但當反應達到飽和后，過量的酶會對酶自身產生水解作用，導致提取率有少量降低.因此，最適的加酶量為下腳料質量的1%.

圖6　酶解時間對馬鮫魚油提取率的影響Fig.6　Effect of hydrolysis time on extraction rate of spanish mackerel oil

2.2.6酶解時間對馬鮫魚油提取率的影響在pH值為7，酶解溫度為50 ℃，液固比為2∶1，加酶量為馬鮫魚下腳料質量的1%的條件下，調節酶解時間分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h進行實驗，考察酶解時間對魚油提取率的影響，結果如圖6所示.

由圖6可知：隨著酶解時間的增加，魚油的提取率逐漸升高；當酶解時間達2 h時，魚油提取率達71.2%；繼續增加酶解時間，魚油提取率沒有明顯變化；隨著酶解時間的增加，酶和底物能更加充分地作用.因此，魚油提取率上升.但酶解時間越長，提取魚油的工藝生產周期也越長，不利于工藝生產的經濟效益.因此，最適的酶解時間選擇為2 h.

2.3響應面法優化酶解條件

響應面實驗結果，如表2所示.表2中：δ為提取率.對表2的數據進行多項式擬合回歸，經優化后得到以魚油得率(Y) 為因變量，以加酶量(A)、酶解時間(B)、液固比(C)、酶解溫度(D)為自變量的回歸方程，即

Y=64.37+4.81A+1.28B+4.14C+2.16D+8.45AB+

5.28AC+2.99AD+1.92BC+0.92BD+2.80CD-

7.60A2-3.56B2-3.43C2-11.31D2.

因此，此模型建立成功，適合用于酶法提取馬鮫魚油的條件優化.其中，A，C，D，AB，AC，A2，B2，C2，D2的P值均小于0.05，對魚油提取率影響具有統計學意義，根據模型的線性數值大小，可以得出各因素對魚油提取率的影響大小為A>C>D>B，即加酶量>液固比>酶解溫度>反應時間.加酶量和酶解時間、加酶量和液固比的交互作用對魚油提取率的影響較大.

表2　響應面實驗結果

表3　回歸方程方差分析表

2.4最佳條件預測與驗證

根據Box-Behnken方法分析，得到魚油提取率的最佳反應條件：加酶量為1.5%,酶解時間為3 h,液固比為3∶1,酶解溫度為51.98 ℃.此時,提取率的預測值為77.41%.將其最佳反應條件進行調整：加酶量為1.5%，酶解時間為3 h，液固比為3∶1，酶解溫度為52 ℃，在此條件下進行3次平行實驗，得平均值為75.38%，與理論值接近.這說明采用響應面優化得到的DAG數據可靠，具有預測使用價值.

2.5馬鮫魚油脂肪酸組成分析

對提取的馬鮫魚油進行GC/MS分析，結果如表4所示.表4中：η為質量分數.由表4可知：從馬鮫魚油分離出12種脂肪酸，多不飽和脂肪酸以二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)為主.由此可知：馬鮫魚油中EPA和DHA的質量分數比一般魚類的高[11,13-14]，具有一定的開發利用價值.

表4　馬鮫魚油脂肪酸組成

3　結論

1) 通過馬鮫魚下腳料提取單因素設計和響應面優化,得到馬鮫魚油提取的預測模型.最佳提取條件：pH值為7，中性蛋白酶加酶量為馬鮫魚下腳料質量的1.5%，酶解時間為3 h，液固比為3∶1，酶解溫度為52 ℃，馬鮫魚油提取率為75.38%.

2) 采用GC/MS對馬鮫魚油進行分析，檢測出12種脂肪酸.其中，棕櫚酸的質量分數最高，達到22.98%；不飽和脂肪酸質量分數為54.13%，油酸質量分數最高.多不飽和脂肪酸以EPA，DHA為主，EPA的質量分數為8.40%，DHA質量分數為7.06%，馬鮫魚油的EPA和DHA的質量分數比一般粗魚油更高.

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(責任編輯： 錢筠英文審校： 劉源崗)

Optimization of Enzymatic Extraction Conditions of Spanish Mackerel Oil by Response Surface Methodology

HUANG Huili1, TONG Jiqiang1, WANG Yong2, MA He1

(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Huian Ruifang Food Corporation Limited, Quanzhou 362131, China)

In order to improve the comprehensive utilization value of spanish mackerel (Scomberomorusniphonius), the single factor and response surface optimization experiments were used to study the extraction process of oil from spanish mackerel waste and the fatty acid composition was also analyzed. Experiment results showed that: pH 7.5, dosage of neutral protease enzyme 1.5%, hydrolysis time 3 h, rate of liquid to material 3∶1, and hydrolysis temperature 52 ℃ were the optimal processing conditions. Under these conditions, the extraction rate of spanish mackerel oil was 75.38%. Furthermore, by fatty acid analysis of spanish mackerel oil, 12 kinds of fatty acids were determined. The unsaturated fatty acids were 54.13% of the total fatty acids, and EPA was 8.40%, DHA was 7.06%, which showed higher content of EPA and DHA.

spanish mackerel oil； enzymatic hydrolysis; fatty acid; response surface methodology

10.11830/ISSN.1000-5013.201605014

2015-09-28

黃惠莉(1962-)，女，教授，主要從事海洋水產資源開發利用的研究.E-mail:hlhuang@hqu.edu.cn.

福建省重點科研資助項目(2013N0022)

TS 224； TQ 644

A

1000-5013(2016)05-0595-05