冠脈搭橋術患者心外膜、胸腔內脂肪組織中瘦素、基質金屬蛋白-9的表達及臨床意義

董曉龍，屈穎聰，周東東，陳新濤

(焦作市人民醫院，河南焦作454002)

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·臨床研究·

冠脈搭橋術患者心外膜、胸腔內脂肪組織中瘦素、基質金屬蛋白-9的表達及臨床意義

董曉龍，屈穎聰，周東東，陳新濤

(焦作市人民醫院，河南焦作454002)

目的探討行冠脈搭橋術(CABG)患者心外膜、胸腔內脂肪組織中瘦素(Leptin)、基質金屬蛋白-9(MMP-9)的表達及臨床意義。方法 選取擇期行CABG治療的冠心病患者81例， 其中正性血管重構48例，負性血管重構或無血管重構33例。術中從前室間溝留取心外膜脂肪組織(EAT)，從心包外留取胸腔內脂肪組織(TAT)，分別采用免疫組織化學染色和實時熒光定量PCR檢測EAT、TAT中Leptin、MMP-9蛋白及基因表達。結果 EAT Leptin和MMP-9蛋白陽性表達率均高于TAT，EAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表達量均高于TAT，兩種組織Leptin、MMP-9蛋白及基因表達差異均有統計學意義(P均<0.05)；正性重構患者EAT中Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表達量均高于負性或無重構患者，差異均有統計學意義(P均<0.05)。結論 行CABG治療的冠心病患者EAT中Leptin和MMP-9表達增多，且二者表達與血管正性重構有關。

冠脈搭橋術；心外膜脂肪組織；瘦素；基質金屬蛋白-9；血管重構

研究表明，脂肪組織不僅與能量代謝有關，而且可分泌瘦素(Leptin)、基質金屬蛋白-9(MMP-9)等多種脂肪因子參與炎癥或免疫反應[1]。心外膜脂肪組織(EAT)作為心肌表面脂肪組織具有分泌活性，可通過旁分泌參與動脈粥樣硬化形成及進展[2]。有研究指出，EAT密度與冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成及性質密切相關[3]。本研究檢測EAT中Leptin和MMP-9表達，并與胸腔內脂肪組織(TAT)中Leptin和MMP-9表達進行比較，探討其在冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成中的意義以及與斑塊穩定性的關系。

1　 資料與方法

1.1臨床資料2014年2月～2015年8月本院擇期行冠脈搭橋術(CABG)治療的冠心病患者81例，男47例、女34例，年齡38～74(56.1±11.7)歲，冠心病病史1～8年、平均(4.2±1.7)年。根據美國紐約心臟病學會(NYHA)心功能分級標準：Ⅱ級22例，Ⅲ級41例，Ⅳ級18例。術前血管內超聲成像系統檢測示血管負性或無重構(重構指數≤1.05)33例、正性重構(重構指數>1.05)48例。81例中，排除中重度瓣膜反流或狹窄者、左心室射血分數低于50%者、惡性腫瘤患者、肝腎功能不全者、甲狀腺疾病者以及CABG禁忌證患者。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者對該研究均知情同意。

1.2EAT和TAT獲取患者均在全麻體外循環下行CABG，術中從前室間溝留取EAT約1 g，同時從心包外留取TAT約1 g。取出后分成2份，1份迅速置于液氮中保存以備檢，另一份浸泡于4%甲醛溶液中以供免疫組化檢測。

1.3EAT、TAT Leptin、MMP-9蛋白表達檢測采用免疫組織化學染色法。將甲醛固定組織標本常規石蠟包埋，連續進行切片，利用EnVision二步法分別進行Leptin和MMP-9組織化學染色。兔抗人Leptin和MMP-9多克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供，免疫組織化學檢測試劑盒由美國Zymed 公司提供。組織切片行HE染色后，分別由兩位具有主治醫師職稱以上的病理科醫師獨立閱片。結果判定：細胞Leptin蛋白陽性表達為細胞質中出現棕黃色或黃色顆粒狀物質，MMP-9蛋白陽性表達為細胞核或細胞質中出現棕黃色或黃色顆粒狀物質。每張切片觀察5個高倍視野進行陽性細胞計數，計算陽性細胞比例。陽性細胞比例<10%為陰性(-)，10%～25%為弱陽性(+)、26%～75%為陽性(++)、>75%為強陽性(+++)。

1.4 EAT、TAT中Leptin、MMP-9 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。分別取EAT或TAT 50 mg，用勻漿器進行處理后，利用Trizol總RNA提取試劑盒(購自上海生工生物公司)對組織中總RNA進行提取，純化后檢測純度，取A260/A280>1.80樣品完成后續實驗。利用逆轉錄試劑盒(購自美國Invitrogen公司)進行逆轉錄獲得第一模板鏈cDNA，以cDNA為模板使用PCR試劑盒(購自美國Invitrogen公司)完成PCR。Leptin、MMP-9和內參引物均由寶生物工程(大連)有限公司設計合成。Leptin引物：上游5′-GATGACACCAAAACCCTCATC-3′，下游5′-GCCACCACCTCTGTGGAGTAG-3′； MMP-9引物：上游5′-CACCAAACTGGATGACGATG-3′，下游5′-GATGCGTGGAGAGTCGAATC-3′；β-actin引物：上游5′-CCGGGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游5′-TGCTGTCGCCTTCACCGTTC-3′。PCR反應條件：95 ℃、60 s，92 ℃、30 s，56 ℃、25 s，74 ℃、25 s，連續進行38個循環，每個樣品均設置三個平行反應復孔。用2-△△Ct法獲得EAT和TAT中Leptin mRNA、MMP-9 mRNA表達量。

2　結果

2.1EAT和TAT Leptin、MMP-9蛋白表達EAT Leptin和MMP-9蛋白陽性表達率均高于TAT，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1　 EAT和TAT Leptin和MMP-9蛋白表達比較[例(%)]

2.2EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表達EAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表達量均高于TAT，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2　EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表達比較

2.3不同血管重構患者EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表達 正性重構患者EAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表達量均高于負性或無重構患者，差異均有統計學意義(P均<0.05)；正性重構患者TAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表達量與負性或無重構患者無差異(P>0.05)。見表3。

表3　　　　不同血管重構患者EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表達比較

3　討論

冠狀動脈粥樣硬化是冠心病發生的主要原因，冠狀動脈粥樣硬化斑塊性質與患者病情及預后密切相關[4]。EAT作為與冠狀動脈距離最近的脂肪組織，越來越多的研究表明，冠狀動脈粥樣硬化早期血管壁內皮破壞及內膜增厚與EAT有關[5～7]。亦有研究指出，EAT可分泌炎性因子而參與動脈粥樣硬化的發生及進展[8]。Leptin是EAT產生的炎性因子之一，可通過旁分泌而加速易損斑塊中血管生成，而新生血管又可使斑塊體積進一步增大，斑塊內炎癥細胞及脂質進一步增多[9]。MMP-9作為促進細胞外基質降解的主要因子，亦可加速血管中層彈力膜及斑塊纖維帽降解，從而加速斑塊易損性及血管正性重構[10]。本研究中免疫組化和實時熒光定量PCR檢測結果均顯示，EAT Leptin和MMP-9蛋白陽性表達率和基因表達量均高于TAT，說明EAT可大量產生Leptin和MMP-9，可能參與了冠心病冠狀動脈粥樣硬化病程進展。

研究表明，血管重構與冠狀動脈粥樣硬化斑塊性質密切相關[11]。有研究指出，動脈粥樣硬化血管出現正性重構時，炎性細胞數量顯著增加、MMP分泌增多，而血管平滑肌減少、膠原分解增多，使動脈粥樣硬化斑塊穩定性降低，易發生破裂[12]。影像學檢查結果亦顯示，正性重構是不穩定型心絞痛的主要類型，斑塊性質主要為脂質性斑塊，而負性重構或無重構則是穩定型斑塊主要類型，斑塊性質主要為鈣化或纖維斑塊[13,14]。本研究顯示，正性重構患者EAT中Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表達量均高于負性或無重構患者，而TAT中兩者無差異，說明EAT中Leptin、MMP-9表達增加與正性重構有關。分析其原因可能為：Leptin可加速血管生成，從而使粥樣斑塊中滋養血管密度增加；同時，亦可促使組織組織中脂肪酸、甘油三酯分解，這些因素均可導致冠狀動脈粥樣硬化斑塊易損性的發生[15]。MMP-9可通過作用于血管中層彈力膜及斑塊纖維帽而直接參與血管重構，同時MMP-9亦可通過使細胞外基質降解協同Leptin促進血管新生[16]；兩者共同作用加速了斑塊的易損性。

綜上所述，行CABG治療的冠心病患者EAT中Leptin和MMP-9表達增多，Leptin和MMP-9共同參與了血管重構，與冠狀動脈粥樣硬化斑塊易損性密切相關。

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