抗紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原哈維弧菌單克隆抗體的制備及特性分析

秦藝丹 李男 李洋

摘要 以紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原——哈維弧菌2SYX002為抗原，通過雜交瘤技術制備了抗哈維弧菌的單抗1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 和 2C1。特性分析結果表明：有8株單克隆抗體（1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6、6G6）特異性較差，與試驗中所有菌株均發生反應；有6株（4A7、4E12、7D7、8E10、4D12、2B9）只與免疫菌株哈維弧菌2SYX002反應，與其他菌株均不發生反應。5株單抗（2E7、5B2、1G2、2C1 、1G3 ）與部分參考菌株有不同程度交叉反應；通過進一步特性分析，從中篩選出單克隆抗體2C1，其抗原包被濃度為5×107 cells/mL時，與試驗中所有哈維弧菌分離株反應均為陽性，除溶藻弧菌外不與其他參考菌株發生交叉反應，效價為1：256。本研究擴充了哈維弧菌單克隆抗體庫，為哈維弧菌單克隆抗體的進一步應用提供參考數據。

關鍵詞 哈維弧菌；紅鰭東方鲀；單克隆抗體；特性分析

中圖分類號 S941.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）08-0239-01

Abstract In this paper， 6-week-old BALB/c mice were immunized with Vibrio harveyi 2SYX002 （isolated from dermal ulcer of Fugu rubripes） for monoclonal antibody preparation. After cell fusion，，screening， sub-cell clone， and so on， 19 hybridoma cell lines were obtained and named（1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 and 2C1）.ELISA results showed that the MAb 1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 and 6G6 had positive reaction with all of the standard and isolated strains.The mAb of 4A7、4E12、7D7、8E10、4D12 and 2B9 had no crossreaction with other 11 standard bacterial strains， only specific reaction with the immuned bactria. MAb 2E7、5B2，、1G2，、2C1 and 1G3 had cross-reacted with tested strains， such as Vibrio.parahaemolyticus， Vibrio.damsela and so on. Among them， MAb 2C1 only had positive reaction with all strains of Vibrio.harveyi and Vibrio.alginolyticus（the titer was 1：256）， without other 11 standard bacterial strains. The present results provided the basis for the preparation of immunochromatographic test strip to rapid detection Vibrio. harveyi.

Key words Vibrio harveyi；Fugu rubripes；monoclonal antibodies；characteristic analysis.

哈維弧菌（Vibrio harveyi）又稱哈氏弧菌，廣泛存在于海洋環境中，是海水養殖業中一種常見的致病菌。其宿主十分廣泛，是對蝦發光病的主要致病菌[1-2]，還可引起多種海水養殖魚類潰瘍病[3-5]，其中紅鰭東方鲀皮膚潰爛病，具有傳染性較強，死亡率較高的特點。哈維弧菌是該病主要病原菌之一，患病魚體出現表皮潰爛，伴隨全身性出血，病灶處肌肉組織嚴重液化，肝臟等器官嚴重損傷，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。由于哈維弧菌遺傳特征和生理生化特征復雜多樣，并且與其近緣種在表型上有很高的相似性，依靠傳統的檢測方法檢出率低，而且需依賴專業的技術和設備，耗時長、操作復雜，難以實現對疾病的及時診斷與防治。因此，發展哈維弧菌的快速檢測技術在致病性弧菌診斷中有重要意義。基于免疫學原理的熒光抗體技術及酶聯免疫吸附技術可以實現快速、特異的檢測哈維弧菌。目前，Robertertson等制備了哈維弧菌的多克隆抗體[9]，但多抗血清具有明顯的異質性，特異性較差。與之相比，單克隆抗體特異性高，其檢測結果更準確可靠。本試驗利用滅活的紅鰭東方鲀“皮膚潰爛病”病原——哈維弧菌2SYX002作為抗原免疫小鼠，制備了抗哈維弧菌的單克隆抗體，并對其進行了特性分析，為哈維弧菌的快速檢測技術的發展提供了物質基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

哈維弧菌Vibrio.harveyi（ATCC35084）、燦爛弧菌Vibrio.splendidus（ATCC33125）、副溶血弧菌Vibrio.parahaemolyticus（KCTC2471）、溶藻弧菌Vibrio.alginolyticus（KCCM40513）、創傷弧菌Vibrio.vulnificus（ATCC2126）、美人魚弧菌Vibrio.dams-ela（ATCC33539）、鰻弧菌Vibrio.anguillarum（KCTC2711）、希瓦氏菌Shewanella oneidensis（KCCM41821）、河豚鏈球菌Streptococcus iniae（KCTC3657）、殺鮭氣單胞菌Aeromonas salm-onicida（MT004）、遲緩愛德華菌Edwardsiella tarda（ATCC15-947）均由韓國釜慶大學疾病預防實驗室贈送。

免疫用哈維弧菌2SYX002由大連海洋大學王斌老師惠贈。其他5株哈維弧菌分離株2SYX001、2SYX003、2HWM001、2HWM002和2SYX005均由實驗室保存。

試驗用Balb/C小白鼠購自大連醫科大學SPF實驗動物中心。聚乙二醇（PEG1500）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、堿性磷酸酶（AP）標記的羊抗小鼠Ig、對硝基苯磷酸鹽（pNPP）均購自Sigma公司。RPMI-1640培養液、胎牛血清購自HYCLONE公司。

1.2 單克隆抗體的制備

以哈維弧菌2SYX002為抗原，免疫6周齡Balb/C小鼠后取其脾細胞與SP2/0細胞在PEG作用下融合。采用間接ELISA篩選出陽性雜交瘤后，再用有限稀釋法獲得單克隆細胞株。具體操作方法參照文獻[10]。

1.3 單克隆抗體的特性分析

1.3.1 特異性分析。采用間接ELISA法，分別用哈維弧菌2SYX002和 11株參考菌株作為包被抗原，濃度為5×107 cells/mL，單克隆抗體作為一抗，SP2/0上清為陰性對照，具體操作步驟參見文獻[11]。

1.3.2 適用性分析。采用間接ELISA法，分別用哈維弧菌

2SYX002和5株哈維弧菌分離株作為包被抗原，濃度為5×107（下轉第260頁）

（上接第239頁）

cells/mL，單克隆抗體作為一抗，SP2/0上清為陰性對照，具體操作步驟參見文獻[11]。

1.3.3 效價測定。采用棋盤滴定法對單克隆抗體的效價進行測定。哈維弧菌2SYX002包被濃度為5×107 cells/mL，10倍梯度稀釋至5×105 cells/mL。將所得的抗哈維弧菌單克隆抗體原液以2倍比進行稀釋至210，進行間接ELISA試驗。具體操作步驟參見文獻[11]。

2 結果與分析

2.1 雜交瘤細胞株

經篩選和克隆后共獲得19株穩定分泌抗哈維弧菌2SYX002單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6和2C1。

2.2 單克隆抗體的特異性、適用性及效價

對19株陽性單克隆抗體進行特異性試驗，其中1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 和 6G6 與所有試驗菌株反應均為陽性；單抗4A7、4E12、7D7、8E10、4D12和 2B9 只與免疫菌株哈維弧菌 2SYX002 反應；其余5株5B2、 2C1 、1G2、1G3和 2E7與副溶血弧菌、溶藻弧菌、美人魚弧菌、鰻弧菌、希瓦氏菌及遲緩愛德華菌有不同程度的交叉反應；2C1可以識別所有哈維弧菌的參考菌株及分離株（表1），且只與溶藻弧菌有交叉反應。單克隆抗體5B2、 2C1 、1G2、1G3 、2E7的效價分別為1∶4、1∶256、1∶64、1∶64、1∶128。

3 討論

本試驗用甲醛滅活的哈維弧菌為抗原，運用雜交瘤技術，成功制備并克隆了19株能夠穩定分泌抗哈維弧菌 2SYX002單克隆抗體的雜交瘤細胞。特異性試驗結果表明，所得的單抗與弧菌屬細菌存在較強的交叉反應，其原因可能是由于弧菌屬的細菌具有較高的相似度，親緣關系較近。使用全菌作為抗原于免疫小鼠，與其他弧菌屬細菌存在相同抗原。陳昌福等[12]用哈維氏弧菌LPS免疫同腹異育銀鯽，發現哈維弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌三者脂多糖有部分相同抗原。在郝貴杰等[13]的研究中，用制得的哈維弧菌單抗的腹水做交叉反應試驗結果表明，哈維弧菌與溶藻弧菌、麥氏弧菌和副溶血弧菌的表面抗原就擁有相似的抗原決定簇。

此外，張元興等在抗遲緩愛德華菌單克隆抗體制備中，分別使用全菌和鞭毛蛋白作為抗原，比較其免疫小鼠效果，發現前者免疫后小鼠抗血清效價較后者低，不適于雜交瘤試驗[14]。因此，今后試驗中可通過以特異性蛋白為抗原免疫小鼠來提高抗體的特異性。

試驗所得的單克隆體的效價與同類文獻相比較低，可能是由于檢測中使用的抗體為雜交瘤細胞培養液上清。郝貴杰等[15]制備的抗哈維氏弧菌脂多糖單克隆抗體雜交瘤細胞株，其細胞培養液上清ELISA效價為1∶1 600，腹水效價為6.4×104，得到大幅度提高。后續試驗中可通過誘生小鼠腹水進一步提高抗體效價。本研究擴充了哈維弧菌單克隆抗體庫，為哈維弧菌單克隆抗體的進一步應用提供更多參考數據。

4 參考文獻

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