一株鴨瘟病毒的分離與鑒定

馬圣利

摘要 鴨瘟病毒是引起鴨、鵝等禽類急性、敗血性傳染病的主要病原，可造成鴨群規(guī)模性死亡，嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展。本文通過分析江西上饒某鴨場的一例鴨瘟病例，總結(jié)鴨瘟病毒的分離、鑒定方法，以期為廣大養(yǎng)鴨大戶提供參考。

關(guān)鍵詞 鴨瘟病毒；分離；鑒定

中圖分類號 S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）08-0261-02

鴨瘟，俗稱“大頭瘟”，是一種高致病性傳染病，多發(fā)生于成年種鴨和蛋鴨，我國于1957年首次報(bào)道此病。鴨瘟在臨床上主要表現(xiàn)為高稽留熱、精神不振、痢疾、流淚、頭頸腫大等，其病原為鴨瘟病毒，是一種皰疹病毒[1]。隨著規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鴨瘟的發(fā)病率逐漸升高，在同一地區(qū)或同一養(yǎng)鴨場間傳播迅速，且死亡率非常高，沒有免疫接種過的鴨群死亡率高達(dá)100%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文就廣豐區(qū)某鴨場的一起鴨瘟病例，通過對其病原進(jìn)行分離鑒定，總結(jié)鴨瘟病毒的分離鑒定方法，為鴨瘟病毒的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 鴨瘟病鴨臨床資料

病鴨病初精神沉郁，食欲不振，接著拉黃綠色糞便，肛門周圍的羽毛結(jié)塊；眼結(jié)膜充血、眼瞼水腫、頭部腫大；雙翅下垂，不愿走動；3 d后死亡。

2 鴨瘟病毒分離

鴨瘟病毒主要通過侵害鴨的免疫器官而引發(fā)鴨瘟，因此通常從病鴨的血液或肝臟、脾臟、腎臟等組織中分離出鴨瘟病毒。主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、鴨胚分離、雛鴨分離3種方法[2]。

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

研究表明，鴨瘟病毒接種到鴨胚成纖維細(xì)胞中，可提高成纖維細(xì)胞的產(chǎn)毒能力，蝕斑明顯，病毒分離效果好。將無菌病料接種到鴨胚成纖維細(xì)胞中培養(yǎng)2～4 d后，若出現(xiàn)細(xì)胞變圓、細(xì)胞聚集成葡萄狀、蝕斑明顯，則表明病毒分離效果好；若無上述病變，可將細(xì)胞多傳幾代，若始終無細(xì)胞病變，則可能是因?yàn)槎局甓玖^小，不足以引起細(xì)胞病變。

2.2 鴨胚分離

無菌病料接種到9～14日齡的鴨胚絨毛尿囊膜中培養(yǎng)4～10 d，通過觀察鴨胚死亡狀況以及鴨胚病理變化來判斷病毒分離效果。病毒分離效果好主要表現(xiàn)為鴨胚死亡，鴨胚內(nèi)呈彌散性出血，胚體出血，部分絨毛尿囊膜上有灰白色壞死灶。若首次分離效果不好，可均質(zhì)化鴨胚絨毛尿囊膜，然后將其盲傳2～4代。

2.3 雛鴨分離

無菌病料肌肉注射到1日齡的雛鴨上飼養(yǎng)3～12 d，觀察雛鴨的死亡狀況。若雛鴨死亡，剖檢病鴨觀察是否具有鴨瘟的典型病變，并結(jié)合免疫熒光技術(shù)或攻毒保護(hù)試驗(yàn)以確診。若雛鴨無死亡，可能是因?yàn)槎局甓玖^少不足以引起病變，可通過檢測雛鴨的抗體水平來確診。

3 鴨瘟病毒鑒定

3.1 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法主要包括血清中和試驗(yàn)（SN）、微量固相放射免疫試驗(yàn)（Micro-SPRIA）、瓊脂糖凝膠沉淀試驗(yàn)（AGP）、反向間接血凝試驗(yàn)（RPHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光技術(shù)6種方法[3]。以上方法均能檢測到鴨瘟病毒，每種方法又有各自的特點(diǎn)，需根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的檢測方法。

3.1.1 血清中和試驗(yàn)（SN）。這種方法是采用固定的血清稀釋病毒或固定病毒稀釋血清的方法接種動物，計(jì)算中和指數(shù)（M），根據(jù)M判斷是否受到病毒感染。若0

3.1.2 微量固相放射免疫試驗(yàn) （Micro-SPRIA）。這種方法是將抗體或抗原用同位素標(biāo)記，然后用能夠吸附抗體的材料作為載體，測定抗體或抗原含量。此方法可以直接檢測病鴨的肝臟、脾臟、血清等病料，是一種特異性強(qiáng)、敏感性高，且快速便宜的方法，但是對試驗(yàn)條件要求較高。

3.1.3 瓊脂糖凝膠沉淀試驗(yàn)（AGP）。這種方法是在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行的一種抗原抗體反應(yīng)，特異性強(qiáng)、操作簡單，對實(shí)驗(yàn)條件要求不高，但是敏感性不強(qiáng)。

3.1.4 反向間接血凝試驗(yàn)（RPHA）。這種方法是利用抗體致敏紅細(xì)胞在相應(yīng)抗原存在時會凝集而進(jìn)行檢側(cè)。這種方法操作簡便，檢測快速，但是敏感性較低，當(dāng)樣品量較少時檢測不出來。

3.1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。這種方法對試驗(yàn)條件、樣品量的要求較低，且操作簡便、檢測快速，結(jié)果容易判斷，是一種非常實(shí)用的檢測方法，在基層推廣起來較容易[4]。

3.1.6 免疫熒光技術(shù)。這種方法的本質(zhì)是抗原抗體反應(yīng)，具有高度特異性、敏感性高、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，但是對設(shè)備的要求高，價(jià)格昂貴，程序操作復(fù)雜，因此這種方法的實(shí)用性不強(qiáng)。

3.2 分子生物學(xué)診斷

3.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。PCR是目前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，對樣品質(zhì)量要求少，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，具有特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡便、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)。較其他診斷方法更能節(jié)約時間，更能為防治提供寶貴的時間。

3.2.2 核酸探針技術(shù)。此技術(shù)主要是將核酸用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記，作為探針以識別待檢樣品中的特定核酸序列。這種方法的準(zhǔn)確性高，結(jié)果較容易判定，對儀器設(shè)備的要求不高，是最早應(yīng)用鴨瘟病毒檢測的分子生物學(xué)方法，也是目前應(yīng)用廣泛的檢測方法。

3.2.3 原位雜交技術(shù)（ISH）。此技術(shù)不僅能夠檢測到鴨瘟病毒，還能將鴨瘟病毒定位，有利于觀察細(xì)胞形態(tài)以及病理變化，是一種將分子生物學(xué)和組織化學(xué)結(jié)合的技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、直觀的特點(diǎn)。此技術(shù)可用于鴨瘟病毒侵染機(jī)體以及其致病機(jī)理的研究。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 徐嬌，宋旭，殷中瓊，等.18味中藥提取物體外抗鴨瘟病毒活性的研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2013（1）：105-110.

[2] 張坤.鴨瘟病毒SDWF株的分離鑒定及致病性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 劉昆.淺談鴨瘟病毒的分離與鑒定方法[J].山東畜牧獸醫(yī)，2014（7）：36-37.

[4] 郭霄峰，廖明，嚴(yán)英華，等.利用PCR檢測鴨瘟病毒[J].中國獸醫(yī)科技，2002（4）：13-16.