脹袋醬油中產氣微生物來源的調查

李婷，張小麗，蔣予箭

(浙江工商大學,浙江 杭州,310018)

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脹袋醬油中產氣微生物來源的調查

李婷，張小麗，蔣予箭*

(浙江工商大學,浙江 杭州,310018)

導致醬油脹袋的微生物一般來自醬油的生產和包裝環境，通過對醬油生產過程中發酵醬醅間、灌裝間和貼標間的空氣中微生物和生產環節發酵醬醅、沉淀罐、生油儲罐、成品油儲罐中醬油產氣微生物的情況進行調查。對車間空氣中的微生物情況調查顯示，發酵車間以霉菌為主，灌裝車間空氣中存在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其亞種(Bacillus subtilissubsp. natto)(J1和J4含量均在102CFU/L左右)，和破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)(J6)兩種類似產氣微生物。生產環節的發酵醬醅、沉淀罐、熟油罐、成品罐醬油樣品中檢測到類似枯草芽孢桿菌的含量分別在105、104、103、102CFU/mL以上，熟油罐和成品罐中檢測到類似破布子乳酸菌的細菌濃度分別在104、102CFU/mL左右。在生產條件及殺菌指標均正常的情況下，提高灌裝車間空氣清潔度和防止熟油罐和成品罐中二次污染是減少醬油產品產生脹袋的必要途徑。

脹袋醬油；車間空氣；生產環節；微生物來源

醬油是以黃豆(或豆粕)、小麥(或面粉、麩皮)為主要原料經微生物發酵釀制而成的一種傳統調味品，富含氨基酸、糖分等營養物質[1]。在環境氣溫高、濕度大的春夏季時，醬油容易出現脹袋現象。通過對產自浙江紹興某廠生產后脹袋醬油中的微生物進行分離，分離出了3種細菌，經鑒定分別是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(J1)、枯草芽孢桿菌亞種(Bacillus subtilissubsp. natto)(J4)和破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)(J6)，它們共同作用導致醬油出現明顯的脹袋現象[2]。污染食品的微生物一般是來自食品所在的環境，環境中的微生物利用食品中豐富營養物質進行侵入，繼而生長繁殖[2-5]。浙江紹興某廠生長醬油的工藝流程如下：

種曲

↓

豆粕、小麥(麩皮)→蒸料→混合接種→圓盤制曲→成曲→制醅→淋澆發酵→淋油→沉淀罐→殺菌→熟油儲罐→配兌→殺菌→成品罐→灌裝→成品

調查脹袋醬油中產氣微生物的來源，應重點研究醬油生產后期環境和環節，可以找出造成醬油二次污染的污染源；對于醬油一次殺菌前的環節也應有所調查，若是污染嚴重，芽孢桿菌的含量較高，后期的滅菌很難將其殺死，也將為后期成品的安全性帶來一定的隱患。由于醬油脹袋大多發生于春、夏季節，這個時候是產氣微生物生長旺盛的季節，故采樣在3～6月份進行[3]。

通過對醬油生產過程中，關鍵工序的醬油中微生物及生產車間環境空氣中微生物的調查，掌握導致醬油脹袋的微生物主要來源，可以切斷污染途徑和控制產氣微生物，這對防治醬油產品的污染具有十分重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1產氣微生物

已經分離出枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(J1)、枯草芽孢桿菌亞種(Bacillus subtilissubsp. natto)(J4)和破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)(J6)共同作用導致醬油嚴重脹袋[4]。

J1菌株、J4菌株、J6菌株在醬油固體培養基上的菌落形態及革蘭氏染色后100倍顯微鏡觀察的個體形態如圖1，圖2，圖3所示。

1.1.2主要培養基

(1)營養瓊脂培養基：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂粉20g，蒸餾水1L，pH7.0～7.2，121 ℃ 滅菌15min。用于空氣采樣和細菌分離。

圖1　J1菌株在營養瓊脂(A)和醬油固體培養基(B)上的形態及革蘭氏染色形態(C)Fig.1　Morphology of J1 strain on NA (A) ， soy sauce agar (B) meduim and gram staining (C)

圖2　J4菌株在營養瓊脂(A)和醬油固體培養基(B)上的形態及革蘭氏染色形態(C)Fig.2　Morphology of J4 strain on NA (A) ， soy sauce agar meduim(B) and gram staining (C)

圖3　J6菌株在醬油固體培養基上的形態(A)和革蘭氏染色形態(B)Fig.3　Morphology of J6 strain on soy sauce agar meduim (A) and gram staining (B)

(2)醬油培養基：大豆蛋白胨5.0g，牛肉浸膏1.5g，氯化鈉5.0g，250mL醬油，蒸餾水750mL，pH:7.0～7.2，121 ℃ 滅菌15min。用于液體空氣采樣。

(3)醬油固體培養基：大豆蛋白胨5.0g，牛肉浸膏1.5g，氯化鈉5.0g，250mL醬油，瓊脂粉20g，蒸餾水750mL，pH:7.0～7.2，121 ℃ 滅菌15min。用于分離醬油中的細菌。

(4)產氣培養基：醬油原油50mL，蒸餾水50mL，pH5.5，加入杜氏管，115 ℃滅菌20min。

在營養瓊脂培養基的配方中添加0.5、4.0、8.0g的氯化鈉制成含0.5%、4%、8%鹽分的培養基。

1.1.3儀器和設備

AR-2140型電子分析天平，奧豪斯國際貿易有限公司；隔水式恒溫培養箱，精宏實驗設備有限公司；NikonE100型生物顯微鏡，上海澤途機電設備有限公司；pHS-3C型酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；GZX-9070MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；YXQ-LS-SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備。

1.2實驗方法

1.2.1生產車間空氣中細菌的采樣

本試驗選用兩種采樣方式，分別使用加入0.5%、4%、8%的含鹽營養瓊脂平皿和液體醬油培養基，固體平皿采樣方法參照GB/T18204.1—2000《公共場所空氣微生物檢驗方法-細菌總數測定》中的自然沉降法[6]；液體采樣選用錐形瓶裝，采樣時打開錐形瓶塞，其他方法同上。

采樣地點：發酵間，灌裝間，貼標間。采樣時間：營養瓊脂平皿在2014年3、4、5、6月份中旬中午12:00～13:00采樣，液體醬油培養基在2014年5、6月份中旬中午12:00～13:00采樣。

結果分析：(1)營養瓊脂平皿采樣結果的分析方法如下：采用肉眼分辨的方法數出培養皿上的菌落數，然后根據奧梅梁斯基公式將菌落數單位轉化為CFU/m3[7]。

(1)

式中：C為空氣中的細菌數，CFU/m3；N為平均菌落數，CFU/皿；A為所用的平板面積，cm2；t為平板暴露時間，min。由公式(1)計算車間空氣中的微生物濃度。

(2)液體錐形瓶采樣結果的分析方法：采用醬油培養基分離其中的微生物，觀察分離出的微生物形態，并計數。

對采集到的微生物，首先通過菌落形態判斷其是否為細菌，對疑似細菌的進行革蘭氏染色顯微鏡觀察個體形態，初步判斷是否和產氣微生物相似。

1.2.2生產環節中細菌的采樣

取樣點：發酵醬醅，沉淀罐，生油儲罐，成品油儲罐。醬油在4個環節的處理流程如下:

使用無菌錐形瓶對各環節取樣調查[8-9]，采樣時間均在2014年5、6月份中旬，中午12:00～13:00進行。

對采集到的樣品采用營養瓊脂培養基和醬油固體培養基分離其中的微生物，并計數。根據分離到的微生物形態不同，對疑似細菌的菌落，進行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察個體形態，初步判斷是否和J1、J4、J6菌株相似。

2　結果與分析

2.1生產車間空氣中細菌的采樣結果

2.1.1固體采樣培養基的篩選結果

空氣采樣選用了含0.5%、4%、8%三種不同鹽分的營養瓊脂培養基，結果發現，用4% 鹽分的培養基采樣效果最好，平皿上的霉菌和酵母菌數量比0.5%鹽分上的少，且細菌的數量和0.5% 鹽分的相同，含量為8% 鹽分的培養基上只有霉菌長出，故選用含4% 鹽分的培養基為最佳空氣采樣培養基。

2.1.2車間空氣固體平皿采樣結果

(1)3、4、5、6月份發酵間空氣中的微生物情況及類似產氣微生物的芽孢桿菌含量及多重比較結果如表1所示；用奧姆斯基公式計算車間空氣每立方米的含菌量，連續4個月采樣空氣中微生物濃度的變化如圖4所示。

表1　不同月份發酵間空氣中含的微生物情況

圖4　不同月份發酵間空氣中細菌和芽孢桿菌的含量Fig.4　Bacteria and bacillus amount in the air of fermentation workshop in different month

5、6月份發酵間的霉菌太多，長滿了平皿，肉眼計數無法計算總的菌落數。由表1和圖4可以看出，發酵間中細菌和芽孢桿菌的含量在3～6月份呈遞增趨勢，這是因為大部分細菌為中溫菌，在25～37 ℃能很好生長，在6月份空氣中細菌含量顯著高于其他3個月份，達到4.4×104CFU/m3，類似J1和J4菌株的芽孢桿菌的含量也最高為1.5×103CFU/m3。參考前人研究，發酵間的環境是清潔的，不會對產品安全有影響[7-8]。

(2)3、4、5、6月份灌裝間空氣中的微生物情況及類似產氣微生物的芽孢桿菌含量及多重比較結果如表2；用奧姆斯基公式計算車間空氣每立方米的含菌量，4個月份空氣中微生物濃度的變化如圖5所示。

表2　不同月份灌裝間空氣中含的微生物情況

圖5　不同月份灌裝間空氣中總的微生物及細菌和芽孢桿菌的含量Fig.5　Microbe, bacteria and bacillus amount in the air of filing workshop in different month

由表2和圖5可以看出，在 3、4、5、6四個月中4月份總的微生物量顯著高于其他3、5、6月，高達3.5

×104CFU/m3，對比之前的研究發現，環境有輕微污染[8]。細菌和芽孢桿菌的含量在這4個月中的變化不顯著，只是霉菌的含量變動較大。經顯微鏡觀察發現灌裝間中含有的芽孢桿菌類似J1菌株，濃度在100CFU/m3左右，含量雖然很低，但若是灌裝間總體環境不好的話，也會存在污染食品的可能，所以在4月份時對灌裝間的空氣環境應加以注意。

(3)3、4、5、6月份貼標間空氣中采樣平皿采集到的微生物情況及類似產氣微生物的芽孢桿菌含量及多重比較結果如表3所示；通過奧姆斯基公式計算車間每立方米的含菌量，4個月采樣空氣中微生物濃度的變化如圖6所示。

表3　不同月份貼標間空氣中含的微生物情況

圖6　不同月份貼標間空氣中總的微生物及細菌和芽孢桿菌的含量Fig.6　Microbe, bacteria and bacillus amount in the air of filing workshop in different month

由表3和圖6可以看出，貼標間總的含菌量3月和5月份無顯著性差異，但與4、6月份相比存在顯著性差異。圖中可以看出4月份總的含菌量最高為3.0×104CFU/m3，這和灌裝間是相似的。3月份總的含菌量最低為9.1×103CFU/m3；5月份的細菌含量最高為1.6×103CFU/m3，在3～6月份期間，芽孢桿菌的含量依次降低。貼標間類似J1和J4菌株的芽孢桿菌在3月份含量最高為3.3×102CFU/m3。

以上結果可以看出，貼標間的環境較差，芽孢桿菌含量較高，貼標間和灌裝間同屬于灌裝車間，若是貼標間的環境控制不好，微生物隨空氣的流通很可能會把這些芽孢桿菌帶入灌裝車間，會對灌裝環境潔凈度的控制造成不利影響[12]。

2.1.3車間空氣液體培養基采樣結果

用液體醬油培養基采集空氣中的兼性厭氧菌，并用醬油固體培養基對其中的微生物進行分離，發現發酵間、灌裝間都含有長在培養基底部的微生物。對培養基底部的微生物進行革蘭氏染色，發現有兩種形態不同菌，結果如圖7所示。

圖7　培養基底部細菌的革蘭氏染色40倍顯微鏡觀察結果Fig.7　Gram staining of bacterial which grown at the bottom of medium 40×observation

由圖7可以看出，編號為A的菌株個體形態呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性，和J6菌株的形態相似，編號為B的個體形態呈短桿狀，橢圓，菌體很小，近似球狀，類似J1、J4菌株的形態。5月份的灌裝間含有類似J6菌株的微生物，細菌繁殖速度快，很快就能增加到幾個數量級，存在污染醬油的隱患。

2.2生產環節中細菌的采樣結果

5、6月份不同環節中含有的類似J1和J4菌株的芽孢桿菌的數量和類似J6菌株的乳酸菌的數量如圖8、9所示。

圖8　5月份各環節芽孢桿菌和乳酸菌的含量Fig.8　Amount of bacillus and lactic acid bacteria of each processes in May

圖9　6月份各環節芽孢桿菌和乳酸菌的含量Fig.9　Amount of bacillus and lactic acid bacteria of each processes in June

從醬油生產環節中分離到了多種芽孢桿菌，此結論與之前的研究相似[11-12]，由圖8和圖9可以看出，類似J1、J4菌株的芽孢桿菌與類似J6菌株的乳酸菌在發酵醬醅中含量最高，發酵醬醅中芽孢桿菌和乳酸菌的含量以6月份最高分別為1.2×105CFU/mL和5.0×105CFU/mL；發酵醬醅經過淋油工序和一次滅菌后管道輸送到沉淀罐，乳酸菌的含量降為0，芽孢桿菌的濃度降到了103CFU/mL；沉淀后的醬油，取上清液輸送到熟油儲罐后，芽孢桿菌和乳酸菌的含量都大幅度增加，分別達到3.9×104CFU/mL和8.9×104CFU/mL；再經二次滅菌后于成品罐儲存，成品罐中的芽孢桿菌和乳酸菌的總含量仍在300CFU/mL以上，5月份的成品罐被類似J6菌株的乳酸菌嚴重污染，平均含量達1.9×104CFU/mL；成品罐是用來存放已經滅菌的醬油，產氣微生物含量過多，在灌裝后很容易二次生產，導致醬油脹袋[13]。

通過以上分析可知，若是醬油由沉淀罐到原油儲罐的環節控制不好的話，熟醬油經調配滅菌后，芽孢桿菌和乳酸菌的總含量是不能降到300CFU/mL以下的，達不到國家規定的標準，此階段應為關鍵控制環節。成品罐中類似J6菌株的乳酸菌的含量在300CFU/mL，而J6菌株處于厭氧環境中時繁殖速度較快。由此可見，從熟油儲罐到成品罐環節有乳酸菌的污染，此階段也為關鍵控制點。找出關鍵控制點后，工廠應依據關鍵控制點制定各項控制指標，對醬油企業設備、技術、管理等方面進行改造，并堅持不懈地持續改進，這是企業實施清潔生產最有效的方式與途徑[15]。

3　結論

(1) 采用4%鹽分的營養瓊脂培養基和液體醬油培養基對發酵間、灌裝間和貼標間3個采樣點空氣中的微生物進行調查，結果表明：發酵間以霉菌為主，類似J1、J4菌株的芽孢桿菌所占比例較小，環境較清潔。灌裝間有類似J1和J4菌株的芽孢桿菌含量在102CFU/m3左右，且含有類似J6菌株的乳酸菌。貼標間中類似J1和J4菌株的芽孢桿菌最高含量為3.3×102CFU/m3不含有類似J6菌株的乳酸菌。灌裝車間中含有導致醬油脹袋的微生物，雖然含量很低，若是控制不好，仍有污染食品的可能，對灌裝車間應適時監控，避免污染食品。

(2) 對發酵醬醅、沉淀罐、熟油儲罐、成品罐4個環節點取樣調查，結果表明：沉淀罐中類似J1、J4菌株的芽孢桿菌含量在103CFU/mL以上，不含有類似J6菌株的乳酸菌。熟油罐中類似J1、J4菌株的芽孢桿菌與類似J6菌株的乳酸菌含量都在104CFU/mL以上，相對于沉淀罐有所升高。成品罐中類似J6菌株的乳酸菌含量在300CFU/mL以上，類似J1、J4菌株的芽孢桿菌含量低于102CFU/mL。由此可見，從沉淀罐到成品罐的輸送管道和罐的厭氧環境中都有污染產氣微生物的可能。

[1]吳婷,宋江,王遠亮.中國醬油釀造工藝[J].中國調味品,2012(6):1-3.

[2]王瑞芝.淺述醬油產氣與防范[J].中國釀造,2005,24(5):1-4.

[3]徐曉新.中國食品安全:問題、成因、對策[J].農業經濟問題,2002(10):45-48.

[4]張小麗,蔣予箭,李峰.導致醬油脹袋微生物的分離與鑒定[J].食品與發酵工業,2014,40(7):51-55.

[5]唐靚,李躍中,朱染楓.微生物對食品安全造成的危害及其控制[J].浙江省醫學科學院學報,2006(64):46-45.

[6]李暄.木薯變性淀粉生產中主要污染細菌的檢測與控制[D].南寧：廣西大學,2011.

[7]GB/T18204.1—2000 公共場所空氣微生物檢驗方法-細菌總數測定[S].中華人民共和國國家標準.

[8]林娓娓,吳曉金,郭倩,等.杏鮑菇栽培工廠的空氣潔凈度評估及微生物群落變化規律調查[J].食用菌學報,2010,17(4):34-39.

[9]卜宇芳,趙良忠,尹樂斌,等.鹵豆干生產過程微生物檢測及安全控制[J].食品科學,2014, 35(5):107-110.

[10]韓振倫.淺談醬油、食醋輸送管道及貯罐、包裝機的除垢滅菌[J].中國釀造，2009(11):74-75.

[11]GB/T4789.2-2010,食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定[S].中華人民共和國國家標準.

[12]KIMYS,KIMC,KWOMSW,etal.Analysesofbacterialcommunitiesinmeju,aKoreantraditionalfermentedsoybeanbricks,bycultivation-basedandpyrosequencingmethods[J].TheJournalofMicrobiology, 2011, 49(3):340-348.

[13]TANAKAY,WATANABEJ,MOGIY.MonitoringofthemicrobialcommunitiesinvolvedinthesoysaucemanufacturingprocessbyPCR-denaturinggradientgelelectrophoresis[J].FoodMicrobiology, 2012, 31(1):100-106.

[14]周娟,王仙園,張穎.空氣微生物污染與控制的研究進展[J].護理研究，2007(21):1 704-1 707.

[15]翁連海,朱亞賢,陳云志,等.低鹽固態發酵法醬油清潔生產標準建立原則與基本內容探討[J].中國釀造,2008,27(21):75-77.

Microbialsourcesofaerogenfromexplosionbagsofsoysauce

LITing,ZHANGXiao-li,JIANGYu-jian*

(CollegeofFoodScienceandBiotechnologyEngineering,ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou310018,China)

Microorganismswhichresultinswollenbagsofsoysaucearegenerallyfromsoysauceproductionandpackagingoftheenvironment.Inthispaper,theconditionofairmicroorganismsduringsoysauceproductioninfermenting,bottlingandlabelingroom,andgas-producingmicroorganismsduringtheproductionoffermentedsauceinsedimentationtankandoiltank,wasinvestigated.Accordingtothesurvey,themicroorganismsintheairoffermentationworkshopmainlywasmold,andmicroorganismsintheairofbottlingworkplaceweretwokindsofsimilargasmicroorganisms, Bacillus subtilis (J1andJ4contentarearound102CFU/L),andLactobacillus pobuzihii (J6).ThecontentofmicroorganismssimilartoBacillus subtilisinfermentationtank,sedimentationtank,cookedinsoysaucesampletankandfinishedproductswere105, 104, 103102CFU/mL.ThecontentofmicroorganismssimilartoLactobacillus pobuzihiiincookedoiltankandfinishedproducttankwere104and102CFU/mL.Soimprovementofaircleanlinessinthefillingworkshopandpreventionofsecondarypollutionincookedoiltankandfinishedproducttankwouldreducetheamountofbulgebagduringsoysauceproduction.

Sauceexplosionandleakagebags；workplaceair；productionprocesses;microbialsources

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608018

碩士研究生(蔣予箭教授為通訊作者，E-mail：13357180599@189.cn)。

食品科學與工程浙江省重中之重一級學科

(JYTsp20142082)

2016-02-28，改回日期：2016-03-30