同位素稀釋—氣相色譜—質譜法測定食用植物油中總氯丙醇脂肪酸酯

李珊 易青 苗虹 吳永寧

摘要建立了食用植物油中總氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）的同位素稀釋氣相色譜質譜（GCMS）檢測方法。樣品經甲醇鈉甲醇溶液水解，硅藻土小柱凈化，七氟丁酰咪唑（HFBI）衍生后，GCMS檢測，同位素內標法定量。3MCPD酯、2MCPD酯、1，3DCP酯和2，3DCP酯在0.050～2.000 mg/L濃度范圍內，均呈良好線性相關，相關系數（R）均大于0.9995。3MCPD酯、2MCPD酯、1，3DCP酯和2，3DCP酯的檢出限分別為0.015， 0.015， 0.030和0.030 mg/kg，定量限分別為0.050， 0.050， 0.100和0.100 mg/kg。以空白特級初榨橄欖油為空白基質的加標回收實驗的平均回收率為87.0%～110.5%，相對標準偏差（RSD）均小于10.1%。在74份食用植物油樣品中，3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的檢出率分別為94.6%， 63.5%和5.4%，未檢出2，3DCP酯；3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的含量分別在未檢出（ND）～10.646 mg/kg、ND～3.617 mg/kg和ND～0.089 mg/kg之間。本方法簡便、準確、可靠，適用于食用植物油中總氯丙醇酯的測定。

關鍵詞 食用植物油； 氯丙醇脂肪酸酯； 氣相色譜質譜法； 同位素稀釋技術

1引言

氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）是存在于含油脂食品中的一類污染物，是脂肪酸與氯丙醇的結合產物，包括單氯取代的3氯1，2丙二醇脂肪酸酯（3MCPD酯）和2氯1，3丙二醇脂肪酸酯（2MCPD酯），以及雙氯取代的1，3二氯2丙醇脂肪酸酯（1，3DCP酯）和2，3二氯1丙醇脂肪酸酯（2，3DCP酯）。已有動物體內實驗證明，3MCPD酯在體內經腸脂肪酶水解后轉化為3MCPD[1，2]。毒理學資料表明，3MCPD具有遺傳毒性、腎臟毒性和神經毒性[3～5]；2MCPD的結構與3MCPD極其相似，其毒性以及可能引起的健康風險不容忽視；1，3DCP可導致小鼠肝臟和腎臟的損傷，2，3DCP對腎臟的損傷作用超過1，3DCP[6]。 Liu等[7]研究了3MCPD 棕櫚酸單酯和雙酯對瑞士小鼠的急性口服毒性以及對NRK52E 大鼠腎臟細胞的毒性，結果表明，3MCPD 棕櫚酸單酯和3MCPD棕櫚酸雙酯均可引起大鼠腎小管壞死、蛋白質管型、生精小管的精子細胞減少等癥狀；3MCPD棕櫚酸單酯可引起大鼠腎臟細胞的細胞毒性，而雙酯則未發現引起細胞毒性的跡象，可見3MCPD 棕櫚酸單酯毒性強于其雙酯。

食品中氯丙醇酯的檢測方法包括間接測定法[8～10]（即氣相色譜質譜法（Gas chromatographymass spectrometry，GCMS））和直接測定法[11，12]（即液相色譜質譜法（Liquid chromatographymass spectrometry，LCMS））。GCMS方法應用較為普遍，文獻報道的各種以GCMS測定氯丙醇酯的方法，絕大多數上是基于德國脂肪科會（DGF）的CVI 18（10）方法[13]，實驗步驟（見圖1，以3MCPD酯為例）主要包括樣品水解、凈化、衍生。在已報道的氯丙醇酯的測定方法中，主要是針對3MCPD酯的測定。鑒于其它氯丙醇及氯丙醇酯的毒性作用，需對氯丙醇酯總量進行測定。

氯丙醇酯主要是在食品加工過程中，尤其是在油脂精煉過程中形成的[14]，污染水平最高的是3MCPD酯[3]，其次是2MCPD酯。食用植物油是人類膳食的重要組成部分。食用植物油中氯丙醇酯污染水平較高[15，16]，由食用植物油引起的氯丙醇酯膳食暴露風險也隨之增高，這使得氯丙醇酯成為近年來國際食品安全研究的重要熱點問題。在各種氯丙醇酯氣相色譜質譜檢測的基礎上，本研究建立了同位素稀釋技術的固相支持液液萃取凈化GCMS方法測定食用植物油中氯丙醇酯總量的檢測方法，通過對74份食用植物油樣品的檢測和參加英國食品分析能力評價項目（FAPAS）國際比對考核，證明本方法簡便、靈敏、準確、可靠，為進行食用植物油中氯丙醇酯的膳食暴露評估提供了有力的技術支持。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent7890 GC5975C MS氣相色譜質譜聯用儀（美國Agilent公司）；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）；G560E渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；NDO400型電熱恒溫鼓風干燥箱（杭州匯爾儀器設備有限公司）；氣密針（1 mL，澳大利亞SGS公司）；NEVAPTM 111型吹氮濃縮儀（美國Organomation Associates公司）。

3氯1，2丙二醇脂肪酸酯（3Monochloropropane1，2diol esters，3MCPD， 純度98%，德國Aldrich公司）；D53MCPD（純度>99%，德國DrEhrenstorfer公司）；雙氯取代的1，3二氯2丙醇脂肪酸酯（1，3Dichloropropan2olesters，1，3DCP），以及D51，3DCP，2，3DCP和D52，3DCP，純度均高于97%，購自美國Fluka公司；2MCPD、D52MCPD、3MCPD棕櫚酸雙酯、D53MCPD棕櫚酸雙酯、2MCPD硬脂酸雙酯和D52MCPD硬脂酸雙酯（純度均≥98%，加拿大TRC公司）；正己烷、乙酸乙酯（色譜純，美國J. T. Baker公司）；冰乙酸（色譜純，美國Tedia公司）；甲基叔丁基醚（分析純，天津市光復精細化工研究所）；七氟丁酰咪唑（HFBI，分析純，美國Alfa Aesar公司）；甲醇鈉（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；無水Na2SO4（優級純，經195℃烘烤4 h后使用，天津市津科精細化工研究所）。ChemElutTM硅藻土小柱（5 g，美國Agilent公司）。

植物油樣品采集于多個食用油脂生產加工企業；將未檢出氯丙醇酯的特級初榨橄欖油樣品作為空白基質樣品。

2.2標準溶液的配制

氯丙醇及其氘代氯丙醇，氯丙醇酯及其氘代氯丙醇酯標準溶液配制：分別準確稱取各氯丙醇、各氘代氯丙醇酯、各氯丙醇酯、各氘代氯丙醇酯標準品適量（精確至0.0001 g），置于不同的10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯定容，分別制備成濃度為1000 mg/L（以氯丙醇計）的標準儲備液，于

Symbolm@@ 20℃儲存。將氯丙醇和氯丙醇酯標準儲備液用正己烷稀釋并定容，配制成10 mg/L的標準使用液。

分 析 化 學第44卷

第6期李 珊等： 同位素稀釋氣相色譜質譜法測定食用植物油中總氯丙醇脂肪酸酯

2.3樣品前處理

2.3.1樣品水解準確稱取0.1 g食用植物油樣品，分別加入濃度為10 mg/L的D53MCPD棕櫚酸雙酯內標使用液102 μL（相當于0.2 μg，以D53MCPD計）、D52MCPD硬脂酸雙酯內標使用液116 μL（相當于0.2 μg，以D52MCPD計）和濃度為10 mg/L 的D51，3DCP和D52，3DCP內標使用液20 μL，加入500 μL甲基叔丁基醚乙酸乙酯（8∶2， V/V），渦旋混勻，加入1 mL甲醇鈉甲醇溶液（0.5 mol/L），充分振蕩，反應4 min后立即加入3 mL冰乙酸10% Na2SO4溶液（1∶29， V/V）和3 mL正己烷，充分渦旋振蕩，棄去上層有機相溶液。

2.3.2 樣品凈化及衍生化將下層水相溶液倒入ChemElutTM硅藻土小柱中，靜置10 min，加入15 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，在洗脫液中加入4 g無水Na2SO4，放置5 min 后，過濾至透明具塞玻璃試管中，于35℃氮吹至近干（約200 μL），用2 mL正己烷溶解殘渣，渦旋混勻，待進行衍生化反應。用氣密針加入40 μL HFBI，立即密塞，渦旋混合20 s，于70℃恒溫箱中衍生20 min后，取出冷卻至室溫，加入10% Na2SO4溶液2 mL，渦旋混合30 s，轉移上層有機相， 并加入0.2 g無水Na2SO4除水后，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾于進樣小瓶中，供GCMS測定。

2.4分析條件

2.4.1色譜條件 色譜柱：DB 5 MS UI 毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；進樣口溫度：250℃；程序升溫：50℃保持1 min，以2℃/min升至90℃，以40℃/min升至250℃，保持5 min；載氣：高純氦；流速1.0 mL/min；進樣體積：1 μL；不分流進樣。

2.4.2質譜條件

離子化方式為電子轟擊（EI），能量70 eV；選擇反應離子監測；電子倍增器電壓1000 V； 離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；溶劑延遲8 min。

3結果與討論

3.1目標化合物的方法學參數的確定

目標化合物經衍生上機測定后，目標化合物衍生物的保留時間和主要質譜參數見表1，質譜裂解圖見圖2（以3MCPD為例）。

3.2內標的選擇

根據文獻[17，18]報道，食品中3MCPD棕櫚酸雙酯的污染水平較高，加之現可采購到商品化標準品，因此，本實驗選擇D53MCPD 棕櫚酸雙酯為內標。對于2MCPD酯的內標，只獲得商品化的D52MCPD硬脂酸雙酯。而對于1，3DCP酯和2，3DCP酯，由于暫不能獲得對應的氘代脂肪酸酯，且鑒于其在食品中的污染水平較低，本實驗暫以D51，3DCP和D52，3DCP分別代替D51，3DCP酯和D52，3DCP酯作為內標進行實驗。

3.3水解液萃取過程中萃取劑的選擇

根據文獻[9，13]報道，在氯存在時，縮水甘油酯可能轉化為氯丙醇酯，故本實驗比較了20% NaCl， 10% NaCl， 20% Na2SO4和10% Na2SO4溶液作為萃取劑的實驗結果。以2014年英國食品分析能力評價項目（Food analysis performance assessment scheme，FAPAS）的食用植物油考核樣品（T2642，其中3MCPD酯的含量為0.579 mg/kg，縮水甘油酯的含量為0.583 mg/kg）和市售菜籽油為研究對象，用以上4種溶液按2.3節實驗方法進行氯丙醇酯的測定（表2）。由表2可知，20% Na2SO4溶液作為萃取劑時，測定結果偏低，可能是萃取后下層水相溶液變渾濁，其中的懸浮物吸附了目標化合物；對于含有0.583 mg/kg縮水甘油酯的T2642樣品， 20%NaCl溶液和10% NaCl溶液作為萃取劑地增加

會錯誤

3MCPD酯的含量，即在樣品前處理過程中，由于使用了含氯試劑，使縮水甘油酯轉化為3MCPD酯[19]。由菜籽油樣品的測定結果可知，10% Na2SO4溶液作為萃取劑的效果更佳，且檢測結果表明該樣品中基本不含有縮水甘油酯。德國脂肪科學學會（DGF）的CⅥ18（10）方法[13]測定縮水甘油酯即是基于此原理。因此，考慮到食用植物油中可能含有縮水甘油酯，本研究采用10% Na2SO4溶液作為萃取劑。

3.4固相支持液液萃取條件的優化

在氯丙醇酯的GCMS測定方法中，大多數以硅藻土進行酯鍵斷裂水解液凈化的文獻[8，19，20]分別以正己烷為淋洗劑，乙醚為洗脫劑。但實驗中發現，采用10 mL正己烷去除油脂和省略此步驟對GCMS檢測基本無影響，且長期（兩周）連續實驗及進樣也不會對儀器的離子源造成明顯的污染，因此本實驗中省略了正己烷淋洗的步驟。

文獻中采用無水乙醚作為萃取劑時[8，19，20]，雙氯丙醇酯的空白加標回收率較低、響應低，即影響方法的準確度，又影響方法的靈敏度；而且乙醚對人體健康、環境及實驗室安全均不利。本實驗以空白特級初榨橄欖油樣品為基質，比較了15 mL無水乙醚、15 mL乙酸乙酯、15 mL二氯甲烷、7.5 mL二氯甲烷和7.5 mL乙酸乙酯順序洗脫，以及15 mL乙酸乙酯二氯甲烷混合液（1∶1， V/V）作為萃取劑的固相支持液液萃取效果。由于本方法采用內標法定量，雖然有些萃取劑的萃取效果不佳，

但考慮到方法的靈敏度，本實驗以待測物的峰面積作為評價萃取效果的指標。實驗結果（圖3）表明，乙醚和二氯甲烷的萃取效率較其它3種萃取劑低，乙酸乙酯和二氯甲烷順序萃取對1，3DCP的萃取效率較低，而乙酸乙酯與乙酸乙酯二氯甲烷（1∶1， V/V）的萃取效率相當。因此，實驗最終選用乙酸乙酯為萃取劑。

3.5線性范圍及檢出限和定量限

在所確定的實驗方法條件下，取氯丙醇系列標準工作液（濃度分別為0.05， 0.1， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6和2.0 mg/L，其中同位素內標濃度均為0.1 mg/L）各2 mL，經HFBI衍生后，以GCMS測定。以氯丙醇標準衍生物的色譜峰面積與其對應的內標衍生物的色譜峰面積之比為縱坐標，氯丙醇與其對應內標的濃度比為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，在0.05～2.0 mg/L范圍內，3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP的衍生物均呈良好的線性關系，相關系數（r）均大于0.9995（表1）。當樣品中的氯丙醇酯濃度超過上述線性范圍時，可以正己烷適當稀釋樣品后再進行檢測。

以空白特級初榨橄欖油樣品中添加4個濃度水平10， 15， 30和50 mg/kg的標準，以3倍信噪比（S/N=3）的響應對應的含量為檢出限，以空白加回收實驗中的最低加標水平為定量限。3MCPD酯和2MCPD酯的檢出限均為0.015 mg/kg，定量限均為0.050 mg/kg；1，3DCP酯和2，3DCP酯的檢出限均為0.030 mg/kg，定量限均為0.100 mg/kg（表1）。

3.6空白加標回收實驗

在0.05～1.0 mg/kg范圍內，在空白特級初榨橄欖油樣品中分別添加4個不同濃度水平的3MCPD棕櫚酸酯、2MCPD硬脂酸酯、1，3DCP和2，3DCP的標準溶液，按2.3和2.4實驗方法進行測定，每個濃度水平做6 份平行樣品，回收率和相對標準偏差結果見表3。由表3可知，4種氯丙醇酯的平均回收率在87.0%～110.5%之間，相對標準偏差（RSD）均小于10.1%；空白加標回收實驗結果表明，本方法的精密度和準確度良好。

3.7本方法與不同氯丙醇酯檢測方法的比較

將本方法與采用間接法的美國油脂化學家協會的AOCSCd 29c13方法[2]、德國脂肪協會的DGFCVI18（10）方法[13]和相關文獻報道的方法進行了比較，詳見表4。這5種檢測方法均是以食用植物油和油

脂作為研究對象，且樣品檢測的取樣量均為0.1 g；從方法的靈敏度來看，本方法的靈敏度最高，單氯丙醇酯的檢出限為0.015 mg/kg，雙氯丙醇酯的檢出限為0.030 mg/kg；就檢測的氯丙醇酯種類而言，方法4[8]和本方法采用HFBI衍生，能夠測定全部4種氯丙醇酯，而其它方法只能檢測3MCPD酯和/或2MCPD酯。與其它方法相比，本方法在操作簡單、經濟、環境友好以及方法的靈敏度方面亦具有一定的優勢。

3.8實際樣品的測定

本方法參加了2014年9～10月FAPAS的食用植物油中氯丙醇酯的國際比對考核（T2642），并提交了3MCPD酯的測定結果0.705 mg/kg（在此次考核提交結果時，將測定值0.601 mg/kg以同批次的空白加標回收率85.2%進行了校正），最終發布的結果為T2642食用植物油考核樣品的統計值為0.579 mg/kg，本實驗室的Z評分為1.1，成績合格，再次證明本方法的可靠性，其總離子流圖如圖4。

對采集的74份食用植物油樣品進行氯丙醇酯的測定，3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的檢出率分別為94.6%， 63.5%和5.4%，含量范圍分別為ND～10.646 mg/kg、ND～3.617 mg/kg和ND～0.089 mg/kg， 未檢出2，3DCP酯（表5）。其中，棕櫚油、芝麻油和玉米油樣品中3MCPD酯和2MCPD酯檢出率為100%；除1份菜籽油、1份大豆油、1份花生油和1份橄欖油樣品中未檢出3MCPD酯，其余70份樣品中均檢出3MCPD酯；其中1份精煉稻米油樣品中3MCPD酯含量超過了10 mg/kg；大豆油和花生油樣品中3MCPD酯和2MCPD酯的污染水平較低；而茶籽油、稻米油、棕櫚油和部分菜籽油樣品中3MCPD酯和2MCPD酯污染水平較高，尤其是棕櫚油污染水平最高；橄欖油中3MCPD酯的污染水平最低，且未檢出2MCPD酯。在所有食用植物油品種中，棕櫚油是氯丙醇酯污染水平普遍較高的品種。

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