超高效液相色譜—串聯質譜法分析雞蛋中利巴韋林及其代謝物殘留

齊凱 湯曉艷 王敏 鄭鋅 楊夢瑞 周劍

摘要 建立了超高效液相色譜串聯質譜法同時快速測定雞蛋中利巴韋林及其兩種主要代謝物TCONH2和RTCOOH的分析檢測方法。樣品采用乙腈水（9∶1， V/V）提取，乙腈飽和正己烷除脂，C18結合GCB進行固相分散萃取除雜，Agilent ZORBAX SBAq色譜柱（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm）分離，超高效液相色譜串聯質譜測定。結果表明：利巴韋林、TCONH2和RTCOOH分別在2.0～200 μg/L， 0.5～200 μg/L， 5.0～200 μg/L濃度范圍內，線性良好，相關系數R2>0.99，檢出限分別為0.54， 0.09和1.54 μg/L，定量限分別為1.79， 0.31和5.13 μg/L。在5.0，10.0和50.0 μg/L加標水平下，利巴韋林和RTCOOH回收率分別為96.1%～99.6%和42.9%～58.3%；在0.5，2.0和5.0 μg/L加標水平下，TCONH2的回收率為75.9%～106.7%，相對標準偏差均為4.2%～12.7%。實際樣品測定結果表明，本方法操作簡單、快速、準確，能夠滿足雞蛋中利巴韋林及其兩種主要代謝物的分析檢測。

關鍵詞 超高效液相色譜串聯質譜； 利巴韋林及其代謝物； 雞蛋

1引言

我國是禽蛋生產和消費大國，禽蛋產量多年來位居世界第一。禽類養殖過程中禽流感以及一些病毒性疾病一直是困擾養殖戶的頭等問題，為了減少損失，人用抗病毒藥物利巴韋林曾被用于獸醫臨床用途。利巴韋林（1βDribofuranosyl1，2，4triazole3carboxamide）是一種人工合成的廣譜抗病毒藥物 [1 ]，在動物細胞內被迅速代謝為TCONH2（1，2，4triazole3carboxamide）和 RTCOOH（1βDribofuranosyl1，2，4triazole3carboxylic acid）等相關代謝產物 [2 ]，利巴韋林及其兩種主要代謝物

圖1利巴韋林、TCONH2和RTCOOH的化學結構式

Fig.1Chemical structures of ribavirin， 1，2，4triazole3carboxamide （TCONH2） and 1βDribofuranosyl1，24triazole3carboxylic acid （RTCOOH）化學結構式見圖1。但利巴韋林具有一定的毒副作用，長期使用可使病毒產生不同程度的耐藥性，誘導新型耐藥病毒的出現，從而影響人類病毒疾病的防治，給人們的身體健康造成危害。因此，我國農業部于2005年發布第 [560 ]號公告，明確規定禁止在動物養殖過程中使用利巴韋林等人用抗病毒藥物 [3 ]。產業調研發現，在我國禽類養殖過程中，違規使用利巴韋林等抗病毒性藥物現象目前仍然十分嚴重，嚴重威脅禽類產品質量安全。因此有必要建立快速、準確、靈敏、高效的利巴韋林及其代謝物殘留檢測方法，為監管提供強有力的技術支撐。

目前，檢測利巴韋林原型的方法有高效液相色譜法（HPLC） [4，5 ]、放射免疫法（RIA） [6 ]、毛細管電泳法（HPCE） [7 ]、液相色譜串聯質譜法（HPLC/MS） [8～12 ]等，目標分析物主要涉及人血漿和動物源性食品。對于利巴韋林及其代謝物的檢測，僅在動物血漿上有報道 [2 ]，雞蛋中利巴韋林及其代謝物的殘留檢測尚無相關報道。本研究采用超高效液相色譜串聯質譜法（UPLCMS/MS）測定雞蛋中利巴韋林及其兩種主要代謝物TCONH2和RTCOOH的殘留量，比較了不同前處理方法，優化了超高效液相色譜和質譜條件，同時進行了方法學評估，并應用于陽性雞蛋樣品中3種殘留物檢測分析。本方法操作簡單、快速、準確，能夠滿足雞蛋中利巴韋林及其主要代謝物的殘留檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜（美國Waters公司）；QTRAP 6500型三重四極桿線性離子阱復合質譜系統（美國AB SCIEX公司）；TTLDCII型氮氣濃縮儀（北京同泰聯科技發展有限公司）；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）。

利巴韋林標準品（德國Dr.Ehrenstorfer公司），純度99.9%；13C5利巴韋林標準品（加拿大TRC公司），純度99.9%；甲醇（HPLC級，德國MERCK公司）；甲酸、正己烷（HPLC級，美國MREDA公司）；乙腈（HPLC級，美國J.T.Baker公司）；實驗用水為MilliQ超純水。

生鮮雞蛋為本實驗所用雞蛋均為實驗飼養蛋雞所產，其中給藥組為對蛋雞連續3天飼喂30 mg/kg利巴韋林原藥，停藥1， 2， 5和7天后采集的雞蛋樣品。

2.2標準溶液配制

分別用甲醇配制濃度為100 mg/L的利巴韋林、TCONH2和RTCOOH標準儲備液，

Symbolm@@ 20℃避光保存。移取0.1 mL利巴韋林、TCONH2和RTCOOH標準儲備液混合，用空白雞蛋提取凈化液稀釋成1.0 mg/L混合基質標準溶液，然后逐級稀釋配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10，20，50，100和200 μg/L共9種不同濃度梯度基質標準溶液。

2.3樣品處理

準確稱取雞蛋液樣品1.0 g（精確至0.01g）置于50 mL具塞離心管中，加入200 μg/L13C5利巴韋林標準溶液100 μL作為內標，加入10 mL乙腈水（9∶1， V/V）提取，5000 r/min離心10 min，轉移上清液至50 mL離心管中。

在上清液中加入5 mL乙腈飽和的正己烷進行除脂，5000 r/min離心5 min，取下層溶液5 mL于10 mL離心管中，加入固相萃取填充料石墨化碳黑（GCB）和C18各50 mg進行凈化，5000 r/min離心5 min， 取上清液氮氣吹干，加1 mL純水復溶，過0.22 μm濾膜后， 采用UPLCMS/MS測定。

2.4色譜條件

色譜柱： Agilent ZORBAX SBAq柱（100 mm×3.0 mm， 1.8 μm）；流動相： A為0.1%（V/V）甲酸溶液，B相為甲醇；柱平衡時間1 min；梯度洗脫程序： 0～2.5 min，99% A；2.5～4.0 min，85% A；4.0～5.0 min，10% A；5.1～8.0 min，99% A；流速0.3 mL/min； 進樣體積5 μL； 內標法定量。

2.5質譜條件

離子源： 電噴霧離子源（ESI）；檢測方式： 多重反應監測（MRM）；掃描方式： 正離子掃描；碰撞氣（CAD）壓力為13.8 kPa；氣簾氣（CMR）壓力為172.4 kPa；霧化氣（GS1）壓力為206.8 kPa；干燥氣（GS2）壓力為1.9 MPa；電噴霧電壓（IS）為5500 V；離子化溫度（TEM）為550℃；MRM定量離子對、去簇電壓（DP）及碰撞電壓（CE）見表1。

3結果與討論

3.1提取溶劑的選擇

利巴韋林屬于強極性化合物，化學結構中包含酰胺基、羥基等基團，其油水分配系數lgP為

Symbolm@@ 2.06 [14 ]，易溶于水和乙腈、甲醇等有機溶劑。目前， 針對動物組織中利巴韋林的提取劑主要有0.1%

甲酸乙腈溶液（1∶9， V/V）、0.1%甲酸20 mmol/L乙酸銨/甲醇溶液（1∶9， V/V）和乙腈水（9∶1， V/V）等 [15 ]。本實驗比較了上述3種提取劑的提取效果。結果表明，0.1%甲酸乙腈溶液（1∶9， V/V）和0.1%甲酸20 mmol/L乙酸銨/甲醇溶液（1∶9， V/V）對利巴韋林及其代謝物并未達到理想的提取效果，且基質響應明顯增大，而乙腈水（9∶1， V/V）對目標物具有很好的提取效果，且基質效應較前兩者明顯變小。分析原因，可能是酸性的提取液會對雞蛋基質中具有與利巴韋林及其代謝物相似基團和結構的物質進行提取，從而導致質譜中基質響應變大，影響目標物分析，故本實驗采用乙腈水溶液（9∶1， V/V）作為提取劑。

3.2凈化條件的選擇

目前，對于生物組織及體液中利巴韋林的凈化方式主要用固相萃取技術（SPE），采用磺酸基強陽離子（MCX）萃取柱、氨基（NH2）萃取柱、苯硼酸基弱陽離子（PBA）萃取柱和親水親脂平衡（HLB）萃取柱等 [16 ]。本方法應用QuEChERS快速樣品前處理方法原理，采用乙腈飽和的正己烷去除溶于提取液中的油脂，用固相分散萃取填料除去脂溶性的雜質和色素等。實驗中考察了3種固相萃取柱填料N丙基乙二胺（PSA）、C18和GCB對利巴韋林及其主要代謝物回收率的影響，如圖2所示。結果表明，PSA對利巴韋林有較大的吸附作用，回收率在76%～79%之間，而C18和GCB對利巴韋林的吸附作用較小，回收率分別在88%～97%和99%～100%。分析原因發現，PSA在吸附基質中的色素、有機酸等生物分子時，對利巴韋林也產生了吸附作用，導致回收率偏低。因此，本研究選用C18和GCB用于固相萃取凈化。此外，本方法與文獻[16]報道的利巴韋林傳統固相萃取法進行了比較，結果表明，采用本方法凈化時，利巴韋林及其代謝物的回收率均高于固相萃取法，且重復性好，凈化時間縮短，成本降低。

3.3色譜質譜條件的選擇及優化

利巴韋林屬于強極性化合物，在C18柱上保留性差。本實驗采用能分離極性化合物的Agilent ZORBAX SBAq色譜柱（100 mm×3.0 mm， 1.8 μm）進行分離，發現利巴韋林在3.06 min處出峰，與RTCOOH達到了有效分離，與代謝物TCONH2分離度不夠，但利巴韋林和TCONH2在后續質譜中電離生成的特征碎片離子對不同（m/z 245/113和m/z 113/96），根據不同特征離子對的質荷比即可準確定量利巴韋林原型和代謝物TCONH2。利巴韋林是核苷類似物，由于雞蛋基質中含有大量的與利巴韋林及其代謝物分子量相同的核苷類似物，導致在提取的過程中，與目標物一同提取出來。這種基質在質譜中響應影響大，用目前的萃取方法難以除去，所以本實驗采用液相色譜將基質與目標物進行了很好的分離，從而消除基質的影響。實驗中發現，氮氣吹干后的樣品用甲醇溶液復溶，在同樣的儀器條件下，利巴韋林及其代謝物在色譜柱中無保留，均在2 min前出峰。且利巴韋林及其代謝物和基質峰重合，由于基質效應影響大，很難對結果進行有效分析。所以本實驗中均采用超純水對處理后的樣品復溶，基質在4.2 min處出峰，與3種目標物達到了有效的分離，保障了目標物準確的定性和定量分析。

本方法也同時考察了以0.1%甲酸甲醇作為流動相時色譜柱對目標物的分離效果。結果表明，在流動相中甲醇的比例超過30%時，利巴韋林及其代謝物在色譜柱上的保留性差，有雙峰出現；隨著甲醇比例減少，水相比例增加，利巴韋林峰形變好且與代謝物達到了有效分離；將水相比例維持在99%進行洗脫，此時得到的利巴韋林峰形較好，出峰時間有效避開了基質峰，排除了基質影響，結果見圖3。

3.4線性范圍、方法檢出限和定量限

為了消除基質效應對測定結果的影響，本方法采用基質標準曲線對利巴韋林及其代謝物進行分析，以定量離子對和內標13C5利巴韋林的峰面積比為縱坐標（Y），以基質標準工作液濃度（0.5，1.0，2.0，5.0，10，20，50，100和200 μg/L）為橫坐標（X）進行線性回歸計算。結果表明，利巴韋林在2.0～200 μg/L濃度范圍內線性關系良好，線性方程為Y=0.0669X+0.0608（相關系數R2=0.9997）；TCONH2在0.5～200.0 μg/L濃度范圍內線性關系良好，線性方程為Y=0.739X+3.79（相關系數R2=0.9931）；RTCOOH在5.0～200.0 μg/L濃度范圍內線性關系良好，線性方程為Y=0.0181X+0.0192（相關系數R2=0.9981）。以信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得到利巴韋林的LOD（S/N=3）為0.54 μg/L，LOQ（S/N=10）為1.79 μg/L；TCONH2的LOD為0.09 μg/L，LOQ為0.31 μg/L；RTCOOH的LOD為1.54 μg/L，LOQ為5.13 μg/L。

3.5方法的回收率和精密度

本實驗采用在空白的雞蛋中添加標準溶液的方法進行添加回收實驗測定，內標法校正，每個濃度點平行測定6次，其加標回收率及精密度結果見表2。

3.6實際樣品分析

應用本方法測定給藥試驗蛋雞所產雞蛋中利巴韋林原藥及其代謝物。經檢測分析，在停藥5天內，雞蛋樣品中均檢測出3種物質利巴韋林、TCONH2和RTCOOH，其中TCONH2殘留量遠大于利巴韋林原型和RTCOOH。隨著停藥時間延長，停藥7天后，雞蛋中均未檢測到利巴韋林原藥和代謝物RTCOOH，但TCONH2仍有殘留檢出，結果見表3。根據雞蛋中利巴韋林及其代謝物殘留消除的規律，確定較長時間段內殘留在雞蛋組織中的目標物為TCONH2，可作為蛋雞養殖中監察違規使用利巴韋林的重要依據。

4結 論

建立了超高效液相色譜串聯質譜檢測雞蛋中利巴韋林及其主要代謝物殘留的方法，針對利巴韋林在組織中殘留量低，轉化率高的特點，分析了利巴韋林及其代謝物TCONH2、RTCOOH在雞蛋中的殘留情況。本方法很好地分離了利巴韋林及其代謝物和基質中的核苷類似物，消除了基質效應影響。實驗中樣品進樣分析時間短，操作簡單，分離度好，回收率高，定量限和精密度基本滿足要求，為實際禽類養殖中利巴韋林的監管提供了有效的方法支撐。

References

1BoschM E， Sanchez A J R， Rojas F S， Ojeda C B. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007， 45（2）： 185-193

2Endres C J， Moss A M， Ke B， Govindarajan R， Choi D S， Messing R O， Unadkat J D. J. Pharmacol. Exp. Ther.， 2009， 329： 387-398

3Ministry of Agricultrue. No. 560 Bulletin of the Ministry of Agricultrue of the People′s Republic of China. [20150112 ]

農業部. 中華人民共和國農業部公告第560號， [20150112 ]

4D′Avolio A， de Nicolo A， Simiele M， Turini S， Agnesod D， Boglione L， Cusato J， Baietto L， Cariti G， Calcagno A， Sciandra M， Di Perri G， Bonora S. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2012， 66： 376-380

5D′Avolio A， Ibanez A， Sciandra M， Siccardi M， de Requena D G， Bonora S， Di Perri G. J. Chromatogr. B， 2006， 835： 127-130

6Austin R K， Trefts P E， Hintz M， Connor J D， Antimicrob M F K. Agents Chemother.， 1983， 24（5）： 696-701

7WANG YongZhong， ZHANG GuoDong， L Bu. Chin. Hosp. Pharm. J.， 2001， 1： 12-13

汪永忠， 張國棟， 呂 布. 中國醫院藥學雜志， 2001， 1： 12-13

8Melendez M， Rosario O， Zayas B， Rodriguez J F. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2009， 49（5）： 1233-1240

9Yeh L T， Nguyen M， Lin C C. J. Chromatogr. Sci.， 2003， 41： 255-260

10WU Fei， DING Li. Chin. J. Med. Inf.， 2011， 8： 3532-3533

吳 飛， 丁 黎. 醫學信息（中旬刊）， 2011， 8： 3532-3533

11WANG WeiXia. Shandong J. Anim Hus & Vete Med.， 2013， 7： 8-9

王維霞. 山東畜牧獸醫， 2013， 7： 8-9

12Yeh L T， Nguyen M， Dadgostari S， Bu W， Lin C C. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007， 43（3）： 1057-1064

13ZHU YongLin， SHAO DeJia， JIANG TianMei， LU GuiPing， WU Qiong. Chin.J.Veterinary Drug.， 2008， 7： 22-25

朱永林， 邵德佳， 蔣天梅， 陸桂萍， 吳 瓊. 中國獸藥雜志， 2008， 7： 22-25

14ZHU WeiXia， YANG JiZhou， YUAN Ping， SUN ChuanLian， WANG CaiJuan， SUN WuYong， ZHANG ShuSheng. Chinese Journal of Chromatography， 2013， 10： 934-938

祝偉霞， 楊冀州， 袁 萍， 孫傳蓮， 王彩娟， 孫武勇， 張書勝. 色譜， 2013， 10： 934-938

15Li W K， Luo S Y， Li S Y， Athill L， Wu A， Ray T， Zhou W， Ke J， Smith H T， Tse F L S. J. Chromatogr. B， 2007， 846（12）： 57-68

16Berendsen B J A， Wegh R S， Essers M L， Stolker A A M， Weigel S. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（4）： 1611-1623