快速基質分散凈化—超快速液相色譜—串聯質譜法同時測定玉米中22種三嗪類除草劑殘留

吳巖 趙偉 劉永 姜冰 魏冬旭 勾越 李麗麗 韓峰 祖元剛

摘要 建立了玉米中撲滅津、莠去津、敵草凈、特丁通等22種三嗪類除草劑多殘留的分析方法。樣品以乙腈為提取劑，經高速勻漿方法提取并濃縮后，以增強型脂質去除凈化劑（EMRLipid）凈化，除去了樣品中的脂質，有效地降低了樣品中的復雜基質所帶來的背景干擾，凈化液再經增強型脂質去除萃取劑（EMRPolish）鹽析萃取，以Kinetex XBC18柱為分離柱，用乙腈和0.1%甲酸溶液進行梯度洗脫，電噴霧正離子（ESI+）多反應模式監測，超快度液相色譜串聯質譜（UFLCMS/MS）測定，基質匹配標準曲線法定量。加標水平為5， 10和20 μg/kg時，22種農藥的回收率為72%～105%，相對標準偏差小于15%。22種農藥的檢出限為0.16～1.8 μg/kg， 在1.0～50 μg/L范圍內線性關系良好（r>0.993）。本方法具有快速、準確、靈敏度高等優點，能夠準確測定玉米中22種三嗪類除草劑的殘留量。

關鍵詞 脂質去除； 快速基質分散凈化； 超快速液相色譜串聯質譜法； 三嗪類除草劑； 玉米

1引言

三嗪類除草劑（Triazine herbicides），又被稱為均三氮苯類除草劑，是目前作為預防農田雜草生長的在世界范圍內應用廣泛的高效除草劑之一。由于該類除草劑的使用量較大，并且具有水溶性強、化學性質穩定殘留時間較長的特點，在使用后容易對農作物、土壤及地表水產生污染，從而進入人類的食物鏈，對人類健康和環境造成嚴重的危害。另外，研究表明，阿特拉津等三嗪類除草劑能夠干擾人體荷爾蒙的正常功能，世界多國已將其列入內分泌干擾物名單 [1 ]。

玉米是我國重要糧食作物之一，種植面積大約3億畝，年產量超億噸，約占世界產量的20%。莠去津等三嗪類除草劑主要用于防治玉米田中一年生雜草，如果在施藥過程中存在濫用、亂用的行為，將對玉米產業造成經濟損失，并且危害食用者的健康。世界各國都對玉米中三嗪類除草劑的殘留量制定了嚴格的限量標準，如美國對玉米中西瑪津、莠去津、撲滅津等除草劑的最大殘留限量為0.25 mg/kg，對特丁凈、環丙津等除草劑最大殘留限量為0.1 mg/kg，對西草凈的限量為0.05 mg/kg [2 ]。我國國家標準GB 27632014中對玉米中莠去津、嗪草酮的限量為0.05 mg/kg，對西瑪津的限量為0.1 mg/kg [3 ]。在我國，三嗪類除草劑是一個大型品種系列，每年產量和使用量都很大，可能對生態環境和食品安全造成極大的危害。

已報道的三嗪類除草劑的分析方法主要有毛細管電泳法（CE） [4 ]、氣相色譜法（GC） [5～7 ]、高效液相色譜法（HPLC） [8～10 ]、氣相色譜質譜法（GCMS） [11～14 ]以及液相色譜串聯質譜法（LCMS/MS） [15～18 ]等，這些方法各有優缺點，CE法對于水樣分析雖具有一定的優勢，但存在檢測器單一，方法適用范圍窄等不足；GC以及HPLC分析三嗪類除草劑主要使用電子捕獲檢測器（ECD）、氮磷檢測器（NPD）和紫外檢測器（UVD），以上檢測器只能以保留時間定性，檢測結果存在假陽性的可能性較大，其在靈敏度及選擇性上存在的不足，導致其所測定的三嗪類農藥種類有限；GCMS與LCMS/MS相比GC和HPLC在靈敏度及選擇性上有一定的優勢，但是由于三嗪類除草劑的水溶性大多較強，農藥的極性也相對較強，GCMS能夠分析的三嗪類除草劑也有限，方法的檢出限也不能完全到達殘留限量的要求。LCMS/MS檢測技術近年來不斷發展，相比于GCMS具有高選擇性、高靈敏度、高通量等優勢，尤其對于水溶性較強的三嗪類除草劑而言，其母體結構含有的N原子在ESI+模式下極易電離，并且能夠獲得較低的檢測限，采用多反應離子監測模式（MRM）定性更加準確。

為了配合高靈敏度的LCMS/MS，降低復雜樣品所帶來的基質干擾對檢測結果的影響，現有的樣品凈化技術也得到了快速發展， 如固相萃取（SPE） [10，12，16 ]、凝膠色譜（GPC） [13 ]、QuEChERS和分子印跡（MIT） [18 ]技術。QuEChERS（Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）技術，是一種分散固相萃取凈化技術，具有提取凈化效率高、環境污染小、操作簡單快速等優點，在三嗪類農藥多殘留檢測中已有應用 [15，20 ]。增強型脂質去除凈化劑（Enhanced matrix removallipid，EMRLipid）是一種新型的高聚物吸附劑，可以有效地吸附脂質中C5及以上碳鏈，尤其對脂質為主要干擾物質的玉米樣品來說，將EMRLipid吸附劑引入QuEChERS凈化步驟中，有效地降低了基質干擾。目前還未見EMRLipid凈化劑用于三嗪類除草劑殘留檢測的報道。

本研究采用EMR QuEChERS與UFLCMS/MS檢測技術相結合的方式，建立了玉米中撲滅津、莠去津、敵草凈、特丁通等22種三嗪類除草劑多殘留的超快速液相色譜串聯質譜（UFLCMS/MS）分析方法，考察了不同提取方式對提取效果的影響及EMRLipid凈化劑的凈化效果。結果表明，本方法操作簡單、快速、選擇性好、準確度高，具有一定的實用意義，為糧谷中三嗪類農藥殘留監控提供了必要的技術支持。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UFLCMS/MS液相色譜串聯質譜儀（Nexera XR液相色譜儀由日本島津公司生產，AB6500+質譜儀由美國ABI公司生產），配有ESI源；T25高速均質器（德國IKA公司）；NEVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；RV10旋轉蒸發器（德國IKA公司）；X22R高速離心機（美國貝克曼公司）；MS3旋混儀（德國IKA公司）。

乙腈、甲醇（農殘級， Sigma公司）；甲酸（LCMS級， Sigma公司）；NaCl（分析純，北京益利公司）；無水MgSO4、無水乙酸鈉（分析純，Sigma公司）。

莠去通、莠去津、疊氮津、草凈津、環丙津、脫乙基另丁津、敵草凈、異戊乙凈、異丙凈、環嗪酮、嗪草酮、撲滅通、撲草凈、撲滅津、另丁津、密草通、西瑪津、西瑪通、西草凈、特丁通、特丁津、草達津等農藥標準品購于SigmaAldrich公司和德國DR公司。

EMRLipid凈化管（含1 g EMR聚合物，使用前需加入與凈化液體積相同的水后混合均勻）、EMRPolish反萃管（含2 g無水MgSO4）、dSPE凈化管（含PSA 150 mg、C18 150 mg和無水MgSO4 900 mg）（美國Agilent公司）。

2.2液相色譜條件

Kinetex XBC18色譜柱（50 mm×2.0 mm，2.6 μm，美國菲羅門公司）；流動相： 由0.1%甲酸溶液（A）與0.1%甲酸乙腈溶液（B）組成，梯度洗脫程序： 0～0.5 min， 10% B；0.5～2.0 min， 10%～50% B； 2.0～4.0 min， 50%～90% B；4.0～6.0 min， 90% B；6.0～6.1 min， 90%～10% B；6.1～8.0 min， 10% B。流速： 0.3 mL/min；進樣量： 5 μL；柱溫箱： 40℃；分析時間： 8 min。

2.3質譜條件

離子源為電噴霧（ESI+），采用正離子MRM模式采集數據。以全掃描、子離子掃描等方式優化每種農藥的母離子和子離子的強度。優化后的質譜分析條件： 噴霧電壓（IS）5500 V；離子源溫度（TEM）600℃；氣簾氣壓力（Curtain gas）35 psi；霧化氣壓力（Gas 1）： 55 psi；輔助加熱氣（Gas 2）：60 psi；碰撞氣（CAD）：9。離子對（MRM）、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數見表1。

2.4標準溶液的配制

準確稱取適量的農藥標準品（純度≥98.0%）， 用乙腈分別配制成100.0 mg/L的標準儲備液；混合標準溶液：根據需要再用乙腈逐級稀釋成濃度為1.0， 2.0， 5.0， 10和50 μg/L的系列混合標準工作溶液。

2.5樣品提取

2.5.1均質提取稱取約10 g試樣（精確至0.01 g）于200 mL三角瓶中，加入20 mL水溶脹30 min，加50 mL乙腈，用均質器于15000 r/min均質提取2 min，提取液經減壓抽濾后，再用20 mL乙腈重復提取殘渣一次，合并2次提取液，用乙腈定容至100 mL。分取50 mL上述提取液于100 mL具塞量筒中，加入10 g NaCl，劇烈振蕩10 min，靜置分層，直至上層乙腈相與水相界面清晰后方可進行下步操作。準確移取乙腈層25 mL于100 mL雞心瓶中，在45℃下旋轉濃縮至近干，用乙腈溶解殘渣，將溶液轉移并定容至5 mL刻度離心管中，待凈化。

2.5.2振蕩提取稱取約5 g試樣（精確至0.01 g），置于50 mL塑料離心管中，加入去離子水10 mL，靜置20 min，向其中加入10 mL 1 %乙酸乙腈溶液，再向其中加入6 g無水MgSO4和1.5 g無水乙酸鈉，蓋上離心管蓋，立刻劇烈振蕩數次，防止結塊，再以1000 r/min旋混2 min（或以手劇烈振蕩提取1 min），提取液于4000 r/min離心3 min，待凈化。

2.6樣品凈化

2.6.1EMR QuEChERS凈化移取2.5節中待凈化溶液5 mL，置于已經加入5 mL水混合均勻的EMRLipid凈化管中，再以1000 r/min旋混2 min（或以手劇烈振蕩提取1 min），再以10000 r/min高速離心5 min，轉移5 mL上清液于EMRPolish反萃管中，劇烈振蕩萃取1 min， 再以4000 r/min離心3 min，取上清液1 mL用0.22 μm有機濾膜過濾，注入UFLCMS/MS 分析。

2.6.2dSPE QuEChERS凈化步驟移取2.5節中待凈化溶液3 mL，置于裝有含PSA 150 mg、C18 150 mg、無水MgSO4 900 mg的凈化離心管中，再以1000 r/min旋混2 min（或以手劇烈震蕩提取1 min），再以10000 r/min高速離心5 min，取上清液1 mL，用氮氣吹至近干，殘留物用乙腈1 mL溶解，再加入含5%甲酸乙腈溶液10 μL，混合均勻，用0.22 μm有機濾膜過濾，注入UFLCMS/MS 分析。

3結果與討論

3.1色譜條件的選擇和優化

本研究考察了流動相分別為乙腈0.1%甲酸和甲醇5 mmol/L乙酸銨兩種不同體系的分離效果，實驗表明，采用甲醇5 mmol/L乙酸銨體系時多數化合物出現峰形拖尾的現象，尤其西瑪津、嗪草酮、疊氮津的拖尾嚴重，嚴重影響其靈敏度。采用乙腈0.1%甲酸體系時，由于流動相水相中有少量酸的加入，明顯改善了堿性化合物的峰型，因此，確定以乙腈0.1%甲酸體系作為流動相。

比較了Kinetex XBC18 （50 mm×2.0 mm， 2.6 μm，簡稱XBC18柱）和Synergi FusionRP（50 mm×2.0 mm， 2.5 μm，簡稱FusionRP柱）兩種不同色譜柱的靈敏度和分離效率。結果表明，絕大多數除草劑在XBC18柱上的靈敏度比FusionRP柱高1～3倍，并且在XBC18的峰型好于FusionRP柱，相同的梯度洗脫條件下XBC18柱的分析時間可控制在6 min以內，相比于FusionRP柱要節省約一半的時間，因此本研究確定使用XBC18柱。22種除草劑的MRM譜圖見圖1。

3.2提取條件的確定

本研究考察了均質提取與振蕩提取兩種方式的提取效率，對22種除草劑在5 μg/kg的濃度水平下進行添加回收實驗，按照2.5節操作，樣品凈化按照2.6.1節操作。結果表明，采用均質提取方式時，22種除草劑的提取效率均在80.7%～104.0%之間，而采用振蕩提取方式時，大多數除草劑的提取效率均在60.7%～88.4%之間，水溶性較強的西瑪津、莠去津、嘧草通的提取效率較差，僅在43.1%～58.6%之間，這可能由于玉米樣品加水后溶脹，加入酸性乙腈等提取試劑后，采用振蕩提取的方式，不能使提取溶劑與樣品基質完全接觸，從而降低了提取效率，而采用均質提取的方式則可以避免以上情況，并且二次提取能夠從根本上保證提取效率。因此，本研究確定采用均質提取方式進行實驗。均質提取與振蕩提取效率的比較見圖2。

3.3凈化效果的比較由于玉米樣品基質中含有較多脂質，這些物質在提取過程中會隨被測農藥同時被提取出來，如果不進一步的凈化，基質效應帶來的干擾會影響檢測結果的準確性。本研究根據被測農藥的性質，結合目前現有的農藥多殘留常用的QuEChERS凈化方法，將EMRLipid高聚物分散劑用于除去樣品中的脂質類干擾物質，簡化了傳統的dSPE QuEChERS凈化過程。考察了EMR QuEChERS與dSPE QuEChERS凈化方式的凈化效果，發現EMR QuEChERS能夠有效的降低基質效應，相比以硅膠基質為主鍵合C18、PSA等固定相的分散劑除去脂質效果更好，使檢測結果的準確度和重現性更好，并且經過EMRLipid凈化后，凈化液由EMRPolish反萃管鹽析后，上清液可經過濾后供UFLCMS/MS直接分析，無需經過氮吹、復溶等步驟，縮短了分析時間。使用不同凈化方式的凈化效果比較見圖3。

從圖3可見，使用EMRLipid凈化劑凈化后的玉米空白樣品總離子流圖背景干擾明顯降低，因此，對于含有脂質類干擾物質的玉米樣品而言，EMR QuEChERS凈化方法為其樣品前處理提供了一種新的選擇，本研究確定使用EMR QuEChERS凈化步驟進行凈化。

3.4方法線性范圍和檢出限

在優化的色譜質譜條件下，進行方法學考察。配制22種除草劑質量濃度分別為1.0， 2.0， 5.0， 10.0和50.0 μg/L的系列混合標準溶液，每種濃度進樣5 μL，以MRM定量離子色譜峰面積（A）對濃度（C， μg/L）建立標準曲線，以3倍信噪比（S/N）計算檢出限（LOD），結果見表2。各組分在線性范圍內，峰面積與濃度成良好的線性關系，相關系數大于0.993。22種除草劑的線性范圍、檢測限及相關系數見表2。

3.5方法的回收率及精密度

本方法采用標準加入法，取已制備均勻的空白樣品，準確加入22種除草劑的混合標準溶液，分別添加濃度為5、10和20 μg/kg的樣品各5份，按上述優化后的方法提取凈化樣品，并進行UFLCMS/MS分析。采用玉米空白基質溶液配制系列標準溶液，外標法進行定量分析，計算平均回收率和精密度（表3），結果表明，所有農藥的回收率均在72%～105%之間，精密度也均小于15%，符合我國國家標準GB/T 274042008中規定的要求 [21 ]。

4結 論

本研究采用EMRLipid凈化技術與超快速液相色譜串聯質譜法（UFLCMS/MS）相結合，建立了一種簡便、快捷的測定玉米中22種三嗪類除草劑多殘留的分析方法，為高脂質樣品的凈化提供了一種新的手段，使快速凈化與確證檢測技術的更好地有機融合，顯著縮短了檢測時間，保證了檢測結果的準確性和再現性。

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