免疫膠體金層析技術在獸醫臨床診斷中的應用

伍宏彪　福建省松溪縣動物疫病預防控制中心　353500

免疫膠體金層析技術在獸醫臨床診斷中的應用

伍宏彪福建省松溪縣動物疫病預防控制中心353500

隨著動物醫學不斷發展創新，免疫膠體金層析診斷技術在不斷發展，有效提高了臨床應用上檢出率與診斷的準確性。本文通過介紹免疫膠體金層析技術的原理、構造、分類應用及診斷來說明該技術在獸醫臨床診斷中的應用價值。

免疫膠體金層析診斷動物疫病臨床

免疫膠體金層析技術在20世紀80年代逐漸發展起來［1］，是繼酶標記、熒光標記和放射性標記之后又一個新的快速的抗原抗體免疫學技術。目前，該技術在醫學領域的應用主要為檢測病原［2］及針對病原在體內產生的抗體［3］，或者妊娠診斷［4］等。動物疫病的診斷與人類醫學診斷相比，往往要對較大的群體或需要到現場進行診斷，因此，更需要簡便快捷的診斷方法。目前免疫膠體金層析技術已成為獸醫疾病檢測中應用最廣泛的免疫學檢測技術之一。

1　膠體金免疫層析技術的原理及構造

免疫層析技術是以抗原抗體反應與色譜層析技術相結合的一種快速免疫分析方法。膠體金免疫層析技術通過將標記了膠體金的抗原或抗體固定在條狀纖維素膜（membrane）上，以形成固相載體，然后將待測樣品以液體形式加入到一端的樣本墊（sample pad）之后，通過液體在硝酸纖維素膜上形成的毛細作用（capillary flow）而向前移動，同時使待測樣品中的受測物與硝酸纖維素膜上的抗體或抗原發生特異性結合而形成免疫復合物。免疫復合物被富集在特定區域（test line），通過膠體金的顏色反應而得到直觀的結果，而游離的標記物則越過檢測帶（control line）進入到末端的吸水墊（wicking pad），不呈現顯色反應。膠體金免疫層析試紙條的構造模式見圖1。

2　膠體金免疫層析技術的分類及結果判斷

膠體金免疫層析按照反應模式可以分為三類，即：間接法、夾心法和競爭抑制法［5］。其中夾心法又可分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法。對未知抗原的檢測常采用雙抗體夾心法和競爭抑制法，而對未知抗體的檢測常采用雙抗原夾心法和間接法。

3　免疫膠體金技術在動物疾病中的應用

3.1傳染病的診斷

3.1.1病毒病的診斷廖圓圓等［6］建立了間接膠體金免疫層析方法用于檢測犬血清中RV IgG抗體，該方法不僅敏感性高（可檢出最低中和抗體效價水平0.5 IU/mL），且與商品ELISA檢測試劑盒的總符合率達到99.4%。陳一鳴等［7］用研制的PRRS抗體試紙條與ELISA檢測方法分別對36份血清樣品進行檢測，結果顯示PRRS抗體試紙條的敏感度為81.5%，特異度為100%，符合率為86.1%，重復性良好。王中力等［8］構建了檢測犬細小病毒（CPV）的間接膠體金免疫層析法，（GICA）敏感性為100%；特異性為97.3%；與HA檢測結果符合率為98.3%，對犬重要傳染性疾病（犬細小病毒病）的診斷提供了快速的檢測方法。因此，膠體金免疫層析診斷方法適合于臨床的快速診斷。

3.1.2細菌病的診斷劉凱等［9］構建了牛出血性敗血癥膠體金免疫層析快速診斷方法，該方法采用雙抗體夾心法檢測牛源巴氏桿菌，經優化后該方法與細菌檢查結果一致性為100%，無交叉反應，穩定性可以維持半年。布日額等［10］建立了檢測牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析方法，試紙條與致病性金黃色葡萄球菌分離鑒定法符合率為90.0%、與PCR試劑盒符合率為83.3%。李偉等［11］建立的炭疽桿菌芽孢膠體金層析檢測技術，胡孔新等［12］建立的快速檢測鼠疫桿菌抗原用的膠體金標記免疫層析方法，諶志強等［13］建立的大腸桿菌0157∶H7膠體金免疫滲濾法等都能夠快速有效地對細菌性疾病進行檢測和診斷。

3.1.3寄生蟲病的診斷王艷華等［14］將構建的膠體金試紙條檢測人工感染弓形蟲GJS株速殖子的7只兔，對兔血清進行檢測，同時用弓形蟲分泌的抗原進行IHA參照。結果顯示，試紙條在第3 d即可檢測出抗體，而IHA法則在第5 d才可檢測出抗體，且該方法對豬瘟及豬衣原體病陽性血清均為陰性，無交叉反應性。曾小軍等［15］建立了檢測血吸蟲的免疫膠體金技術，與IHA抗體檢測技術比較，檢出率分別為95.24%和100.00%；慢性血吸蟲病患者的檢出率分別為92.86%和94.64%。兩種方法對于血吸蟲的檢出效能一致，而膠體金技術對于血吸蟲的檢出效率略低于IHA方法，可能與包被所使用的蛋白及抗體出現的時機相關。

3.2檢驗檢疫檢驗檢疫對于國家進出口貨物，尤其是生物源物品的安全流通具有重要的作用，是關系到國家生物安全的一個重要環節。然而對于進出口關卡的樣品進行檢測，需要快速準確的檢測方法，方能提高效率而不耽誤貨物中轉及旅客流通。動物活體檢疫、動物源性食品及流通過程中的監測，對消費者的消費安全和身體健康具有直接或者間接的影響，同時制約了動物防疫工作切實有效地開展。膠體金免疫層析技術可快速、有效地對現場進行診斷，并可給出診斷結果，對于檢驗檢疫具有較大的現實意義。

4　不同方法試驗對比

4.1試驗材料禽流感H5抗體快速檢測卡，深圳康百得生物科技有限公司生產；H5血凝抑制試驗抗原與陽性血清由哈爾濱獸醫研究所生產；禽血清30份，隨機在散養戶中采集。

4.2試驗數據從試驗數據（見表1）可知，禽流感抗體快速檢測卡與禽流感HI和HA試驗所得出的結果基本一致，區別在于，禽流感HI和HA試驗可以得出準確的數值，而H5抗體快速檢測卡只能定性作出陰性或陽性結果判斷。

5　總結

免疫膠體金層析技術因操作簡便、無須使用儀器設備、快速出結果等優點而被廣泛應用于各個領域。動物疾病診斷不但可幫助畜牧養殖業的健康發展，更重要的可為消費者提供安全放心的動物源性食品。就動物疾病的免疫膠體金層析技術研發而言，選擇何種反應方式、包被抗體或抗原的選擇、檢測抗原或者不同抗原刺激的抗體出現順序等都需要考慮在內。對于細菌引起的疾病，因菌種之間可能存在一定的抗原交叉性，故需要注意診斷方法的特異性。與此同時，還需要盡可能提高試紙條的敏感性，而且對于一項新的檢測技術，往往需要經過長時間的實踐檢驗才能進入臨床應用和推廣。如果能很好地解決免疫膠體金層析試紙條檢測方法的特異性、敏感性和穩定性，而研發出一種比較成熟的檢測技術，無疑具有廣闊的實際應用前景，同時也應成為廣大科技工作者努力的方向。

［1］Faulk W P，Taylor G M.Communication to the editors：an immunocolloid method for the electron microscope［J］.Immuno chemistry，1971，8（11）：1081-1083.

［2］賓羽琳，陳艷，邱燦林.膠體金免疫層析法應用于感染性腸道疾病病原的快速檢測［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18（5）：839-854.

［3］李云，焦春梅.膠體金免疫層析法檢測梅毒螺旋體特異性抗體的方法學評價［J］.實用醫技雜志，2002，9（6）：411.

［4］Beggs M，Novootney M，Sampetro S，et al.A self performing chromatographic immunoassay for the qualitative determination of human chorionic gonadorophin（HCG）in rurine and serum［J］.Clin Chem，1990，36：1084-1085.

［5］任娟.膠體金免疫層析技術研究現狀及進展［J］.新疆畜牧業，2011（12）：22-24.

［6］廖園園，錢金宏，唐利軍，等.檢測犬抗狂犬病毒抗體的膠體金免疫層析法的建立及應用［J］.中國預防獸醫學報，2009，31（9）：705-708.

［7］陳一鳴.豬繁殖與呼吸綜合征抗體免疫膠體金快速診斷試紙的研制［D］.成都：四川農業大學，2011.

［8］王中力，宋曉暉，陳西召，等.犬細小病毒病免疫膠體金診斷技術的研究［J］.中國預防獸醫學報，2004，26（1）：62-66.

［9］劉凱，劉忠清，李德文.牛出血性敗血癥膠體金免疫層析快速診斷方法［J］.動物醫學進展，2012，33（11）：134-136.

表1　不同方法檢測試驗結果

［10］布日額，任曉峰，吳金花，等.牛乳中致病性金黃色葡萄球菌快速檢測膠體金免疫層析方法研究［J］.中國預防獸醫學報，2013，35（11）：907-911.

［11］李偉，王靜，胡孔新，等.應用膠體金免疫層析技術建立炭疽桿菌芽孢的快速檢測方法［J］.中國國境衛生檢疫雜志，2004，27（6）：329-331.

［12］胡孔新，李偉，姚李四，等.建立快速檢測鼠疫耶爾森菌的膠體金免疫層析法［J］.中國國境衛生檢疫雜志，2004，27（6）：332-335.

［13］諶志強，侯楠楠，王新為，等.大腸埃希菌O157：H7的金增強膠體金免疫滲濾檢測法［J］.環境與健康雜志，2011，28（2）：105-108.

［14］王艷華，李克生，才學鵬，等.弓形蟲抗體免疫膠體金快速檢測試紙條的研制［J］.中國獸醫科學，2007，37（1）：29-32.

［15］曾小軍，陳紅根，袁建華，等.快速膠體金免疫層析法的建立及其對血吸蟲病的診斷效果［J］.中國血吸蟲病防治雜志，2005，17（1）：24-27.

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