柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠模型心肌細胞HERG K+通道蛋白的研究

劉建和，楊成龍，蘇聯軍，周正，劉錦霞，唐銀，胡志希，王建國

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410007；3.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠模型心肌細胞HERG K+通道蛋白的研究

劉建和1，2，楊成龍1，2，蘇聯軍3，周正3，劉錦霞3，唐銀3，胡志希2，王建國2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410007；3.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

目的探討柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠心肌中HERG K+通道蛋白表達的影響，為柴胡三參膠囊的臨床應用提供實驗依據，為缺血性心律失常的中醫藥治療提供更多的治療途徑。方法將大鼠隨機分為空白組、假手術組、模型組、柴胡三參膠囊（青蒿）組、柴胡三參膠囊（常山）組、穩心顆粒組、胺碘酮組，每組各10只，藥物組在結扎左冠狀動脈前降支前10 d開始預先給藥，連續10 d，觀察大鼠結扎左冠狀動脈前降支后心電圖改變及心肌中HERG K+通道蛋白表達。結果柴胡三參膠囊能夠降低缺血性心律失常的發生率（P＜0.05）、顯著性的降低大鼠心肌細胞HERG K+通道蛋白的失活（P＜0.01）。結論柴胡三參膠囊抗缺血性心律失常的效果明顯，心肌細胞HERG K+通道蛋白是其作用靶點。

柴胡三參膠囊；缺血性心律失常；HERG K+

〔Abstract〕Objective To investigate Chaihu Sanshen capsule on myocardial ischemic arrhythmia mice HERG K+channel protein expression in ischemic arrhythmia rat models，and provide more experimental basis for clinical use of Chaihu Sanshen capsule.M ethods The rats were random ly divided into blank group，sham-operation group，model group，Chaihu Sanshen（Qinghao）group，Chaihu Sanshen（Changshan）group，Wenxin granule group，amiodarone group，10 rats in each group. The drug group was given pretreatment for 10 days before 10 days of left anterior descending coronary artery.The change of electrocardiogram and myocardial HERG K+channel protein expression in left anterior descending coronary artery was observed.Results Chaihu Sanshen capsule can reduce the incidence of ischemic arrhythmias（P＜0.05），and significantly reduce the HERG K+channel protein inactivation（P＜0.01）.Conclusion The antiarrhythmic effect of Chaihu Sanshen capsules is obvious，and its targets are HERG K+channel proteins.

〔Keywords〕Chaihu Sanshen capsule；ischemic arrhythmias；HERG K+

缺血性心律失常（Ischemic arrhythmias）是冠心病的常見并發癥，是臨床上缺血性心臟病常見的病理生理過程，發病率高，是發生心源性猝死的主要原因，嚴重威脅著人類健康。研究發現心臟HERG K+通道屬于電壓依賴性鉀通道，其介導的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）是人類心肌細胞動作電位3期快速復極的主要電流，是心臟電活動的基礎，心肌缺血主要影響HERG K+通道的失活過程，導致動作電位時程縮短，誘發缺血性心律失常，因此成為致死性心律失常的重要生物靶標［1］。本課題從HERG K+通道進行研究，進一步探討柴胡三參膠囊作用機制，為缺血性心律失常的中醫藥治療提供更多的治療途徑。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級Wistar大鼠70只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［許可證編號：SCXK（湘）2012-0001，動物合格證號（11400700061625，11400700070275）］。

1.2實驗藥物與試劑

柴胡三參膠囊（SHSS）（青蒿與常山均是傳統的抗瘧疾中藥，都具有傳統的抗心律失常作用［1-2］，根據普通高等教育“十一五”國家級規劃教材中藥學第二版，常山有毒，在原有配方不變的情況下，更改常山為青蒿，特在此實驗中分為兩組對比觀察），湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室生產提供柴胡三參膠囊（青蒿）（批號：140403）、柴胡三參膠囊（常山）（批號：140820）；HERG K+通道反應蛋白一抗，北京博奧森生物技術有限公司提供（生產日期：2014-04-18）；二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司提供（批號：K142714C）。

1.3實驗儀器

WD407型小動物呼吸機，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；RM6280型多道生理信號采集處理系統以及圖像識別分析系統，成都儀器廠；光學顯微鏡，上海瀘星光學儀器有限公司。

1.4實驗分組與給藥

將大鼠隨機分為7組：空白組、假手術組、模型組、柴胡三參（青蒿）組、柴胡三參（常山）組、胺碘酮組、穩心顆粒組，各組10只，各組在結扎左冠狀動脈左前降支前10 d開始預先給藥，連續10 d，分別予以生理鹽水、相應藥物灌胃。給藥量按成人70 kg、大鼠200 g體表面積換算（公式為D2=D1×R2/R1），并按重量調整劑量。

1.5動物模型制備

根據朱麗紅［3］、張頁［4］及徐叔云的《藥理實驗方法學》［5］的造Wistar大鼠冠心病氣虛痰瘀模型方法稍作改進。末次給藥30 min后大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）進行麻醉，用生物信號采集器全程記錄II導聯心電圖，氣管切開、插管、接呼吸機。打開胸腔，分離心包膜，輕掀左心耳，從左心耳下緣處進針，在肺動脈旁出針，結扎左冠狀動脈前降支，以II導聯ST段明顯抬高或T波高聳，肉眼觀察結扎線以下心臟表面區域顏色變暗為結扎成功標志，結扎30 min后再灌注40 min。空白組腹腔只麻醉不開胸不結扎，假手術組只開胸不結扎。

1.6大鼠死亡率及心律失常評分

在實驗過程期間，因意外原因死亡大鼠剔除最后數據統計，因惡性心律失常而死大鼠則進入心電圖室性心律失常評分統計，但不進入其他指標檢測項目之中。采用Curtis和Walker（1988）心律失常評分法對心律失常嚴重程度進行定量分析。

1.7HERG K+通道蛋白的表達檢測

應用免疫組織化學檢測法檢測缺血區心肌組織中HERG K+通道蛋白的表達水平。

1.8統計學分析處理

所有數據均用SPSS 22.0統計軟件分析，所有數據均采用“±s”表示。計量資料采用t檢驗，方差不齊者換用校正t檢驗；非正態分布采用Wilcoxon秩和檢驗；所有計數資料均采用χ2檢驗；所有等級資料均采用Wilcoxon秩和檢驗或Ridit分析。

2　結果

2.1各組大鼠死亡情況

在喂養及手術期間，因不明原因突然死亡，或麻醉意外，或多次結扎致大出血等死亡的剔除于心電圖統計分析及最后數據統計，但因惡性心律失常而死亡的大鼠進入心電圖統計分析，但不進入最后的數據統計。在實驗過程中，因室顫死亡的模型組4只，死亡率44.4%；柴胡三參青蒿組2只，死亡率12.5%；柴胡三參常山組2只，死亡率22.2%；穩心顆粒組1只死亡率11.1%；胺碘酮組4只，死亡率40%。

2.2各組大鼠室性心律失常評分

實驗缺血再灌注期間，除假手術組因機械性心肌損傷出現短暫室速外，模型組及SHSS組均有發生多種室性心律失常，與假手術組比較，模型組心室撲動（VP）、心室顫動（VF）發生次數增多（P＜0.01），心律失常評分升高。與模型組比較，SHSS組VP、VF發生次數及心律失常評分明顯降低。見表1。

2.3HERG K+免疫組化染色結果

空白組：心肌細胞排列規則，核呈桿狀，可見橫紋，細胞間質分布均勻，毛細血管豐富，未見炎性細胞浸潤；假手術組：心肌細胞排列欠規則，核呈桿狀，細胞間質分布較為均勻，未見炎性細胞浸潤；模型組：心肌細胞排列紊亂，大量細胞肥大水腫變性，橫紋溶解消失，有大量炎性細胞浸潤；柴胡三參膠囊（青蒿）組：心肌細胞排列較紊亂，部分細胞水腫變性，橫紋溶解消失，間質少量炎性細胞浸潤；柴胡三參膠囊（常山）組：心肌細胞排列紊亂，大量細胞水腫變性，橫紋溶解消失，間質大量炎性細胞浸潤；穩心顆粒組：心肌細胞排列較紊亂，部分細胞水腫變性，纖維斷裂，間質增寬，較多炎性細胞浸潤；胺碘酮組：心肌細胞排列紊亂，大量細胞肥大水腫變性，橫紋溶解消失，有大量炎性細胞浸潤。

表1　各組大鼠心律失常情況及評分（±s）

表1　各組大鼠心律失常情況及評分（±s）

注：與模型組比較：▲▲P＜0.01，▲P＜0.05；與穩心顆粒組比較：★★P＜0.01，★P＜0.05。

組別模型組柴胡三參（青蒿）組柴胡三參（常山）組穩心顆粒組胺碘酮組n 10 8991 0 VP（次）29.20±5.25 4.00±1.69▲▲★3.11±2.03▲▲★2.56±2.13▲▲15.60±3.69▲★★★VF（次）14.5±03.03 2.63±1.60▲▲★2.00±1.66▲▲★1.22±0.97▲▲6.80±1.93▲▲★★VT（次）41214評分（分）5.40±0.52 1.13±0.03▲▲★1.67±0.50▲▲★1.00±0.93▲▲3.60±2.17▲★★

圖1　大鼠缺血區組織形態學光鏡圖（HE染色，×400）

2.4各組間HERG K+通道的蛋白表達水平

將空白組、假手術組、模型組、各藥物組HERG K+通道蛋白平均灰度相比較，結果符合方差齊性及正態分布，采用t檢驗。柴胡三參膠囊能夠顯著性的降低HERG K+通道蛋白的失活（P＜0.01），且柴三（青蒿組）與柴三（常山組）無差異性。見表2。

表2　HERG K+通道蛋白平均灰度組間比較

3　討論

抗心律失常西藥存在致心律失常及安全性等諸多問題，近年來多項臨床研究證實，中藥可通過多靶點、多途徑、多離子通道阻滯和非離子通道調節的整合機制，發揮調節心律失常作用［6-8］。從此共識出發，中醫中藥在心律失常的防治上大有可挖掘之處。柴胡三參膠囊是在認為心悸的基本病機少陽不和，治法為“和解定悸”的指導思路下由小柴胡湯加減而來的。方中以柴胡為君，達肝入少陽，疏泄肝郁、升發肝氣、和解少陽之邪；配伍黃芩，清泄少陽濕熱之邪，柴胡配伍黃芩為經典和法配伍；臣以法半夏下氣化痰，丹參活血清心，苦參通利清火，青蒿截邪并配合柴胡和解少陽之邪；黨參、甘草緩急益氣，調和諸藥共為佐使。全方合用標本兼治，邪去而正安，又扶正兼祛邪，以達和解穩律之目的。柴胡三參膠囊前期臨床及實驗研究也已表明其抗心律失常療效確切［9-12］。

HERG基因編碼的K+通道稱為HERG K+通道，HERG K+通道與室性心律失常密切相關，心臟HERG K+通道屬于電壓依賴性鉀通道，其介導的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）是人類心肌細胞動作電位3期快速復極的主要電流，是心臟電活動的基礎［13］。在本實驗中，結合心電圖統計分析，心律失常發生率低的柴胡三參膠囊組中HERG K+通道蛋白的表達較心律失常發生率高的模型組明顯降低且存在顯著性差異。從而證實HERG K+是柴胡三參膠囊抗心律失常的作用靶點之一。

同時，目前研究得比較清楚的是腎上腺素能對HERG K+通道的調控［14-15］，β1-AR通過Gs蛋白激活腺苷酸環化酶（AC），使細胞內環磷酸腺苷（cAMP）水平升高，cAMP激活蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC），引起HERG K+通道蛋白直接發生磷酸化，刺激加速HERG K+電流外流，減弱HERG K+電流內流導致快速型室性心律失常。本實驗的前期研究了柴胡三參膠囊對缺血性心律失常的大鼠模型缺血心肌中的PKA、PKC表達影響研究，結果亦證實在心律失常發生率低的柴胡三參膠囊組PKA、PKC的表達亦降低。

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（本文編輯李杰）

Effect of Chaihu Sanshen Capsule on M yocardial Cell HERG K+Channel Protein in Ischem ic Arrhythm ia Rat M odels

LIU Jianhe1，2，YANG Chenglong1，2，SU Lianjun3，ZHOU Zheng3，LIU Jinxia3，TANG Yin3，HU Zhixi2，WANG Jianguo2
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007 China；3.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R256.21

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.06.005

2015-12-26

湖南省科技廳科研項目（2013SK3103）；湖南省中醫藥管理局重點課題（201303）；湖南省重點實驗室開放基金計劃項目（2014XNFZ03）；湖南省科技創新項目投資計劃（［2014］658）；2015年湖南省學位與研究生教育教改研究課題（JG2015B071）。

劉建和，男，博士，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：心血管疾病的中醫藥防治。