不同濃度的煙焦油與尼古丁對臍靜脈內皮細胞增殖作用的研究

吳雨徑，張晶*，賴斌，李屹，魏玉杰，劉惠亮*

（1.武警總醫院，北京100039；2.武警后勤學院，天津300309；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410208）

·基礎研究·

不同濃度的煙焦油與尼古丁對臍靜脈內皮細胞增殖作用的研究

吳雨徑1，2，張晶3*，賴斌1，李屹1，魏玉杰1，劉惠亮1*

（1.武警總醫院，北京100039；2.武警后勤學院，天津300309；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410208）

目的研究不同濃度煙焦油與尼古丁對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響。方法采用Ⅰ型膠原酶消化法從人臍靜脈中分離人臍靜脈內皮細胞，Ⅷ因子免疫細胞化學染色方法鑒定分離、培養的臍靜脈內皮細胞（HUVECs），CCK-8法、BrdU染色法檢測不同濃度焦油與尼古丁對HUVECs增殖的影響。結果1、Ⅷ因子免疫細胞化學染色法顯示人臍帶中分離、培養的HUVECs陽性率大于95%。2、細胞培養至6 h，50 mg/L焦油組A（450）值低于對照組A（450），具有統計學意義（P＜0.05）；細胞培養至24 h，50 mg/L焦油組A（450）值低于其他各組A（450）值，具有統計學意義（P＜0.05）；而不同濃度尼古丁組6 h、24 h與對照組相比隨濃度的升高，A（450）值呈現逐漸升高的趨勢，但無統計學意義。3、細胞培養至6 h，不同濃度焦油組BrdU陽性率無統計學意義；細胞培養至24 h，50 mg/L焦油組BrdU陽性率低于其他各組，具有統計學意義（P＜0.05）；不同濃度尼古丁組6 h、24 h與對照組相比BrdU陽性率無統計學意義。結論50 mg/L焦油抑制HUVECs的增殖，尼古丁具有增強HUVECs增殖的趨勢。

焦油；尼古丁；增殖；臍靜脈內皮細胞

〔Abstract〕Objective To observe the proliferation of human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）under different tar and nicotine conditions.M ethods HUVECs were isolated by type I collagenase digestion.After passage cultivation，we used the factorⅧrelated antibody to identify endothelial cell.CCK-8 assay and BrdU staining were used to estimate the effect of tar and nicotine on proliferation of HUVECs.Results 1.Ⅷrelated antibody staining showed that more than 95% were endothelial cells in cultured cells.2.A values at 450 nm of 50 mg/mL tar group were reduced than the control group after culturing for 6 h（P＜0.05）.A value of 50 mg/mL tar group were reduced compared with any other groups after culturing for 24 h（P＜0.05）.With the increasing of nicotine concentration，A values were gradually increased in nicotine groups compared with control group.However，there were no significant differences.3.BrdU positive rates of HUVECs had no significant difference between tar groups compared with control group after cultivation for 6 h.The BrdU positive rate of50 mg/mL tar group were reduced comparing with any other groups after culturation for 24 hours（P＜0.05）.There was no significant difference of BrdU positive rate between nicotine groups and control group after cultivation for 6 h and 24 h. Conclusion The 50 mg/L Tar can inhibit the proliferation of HUVECs，however nicotine has the tendency of stimulate the proliferation of HUVECs.

〔Keywords〕tar；nicotine；proliferation；umbilical vein endothelial cells

吸煙是心血管疾病的獨立危險因素。有報道稱急性冠脈綜合征猝死患者超過三分之二為吸煙人群，而戒煙可明顯減少這類心血管事件的發生［1］。在美國、英國及法國等地城市頒布公共場合禁煙令后，急性冠脈血栓事件的發生明顯減少。在臨床實踐及以往文獻報道［2］發現吸煙可以引起血管內血栓形成，引起急性心肌梗死的發生，是急性冠脈綜合征的獨立危險因素。煙草中尼古丁增加心肌細胞對兒茶酚胺類的敏感性，焦油增加血液中血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）含量，并且對內皮細胞產生細胞毒性［3-5］。但吸煙導致血管內血栓形成的機制仍不清楚［6］。血管內皮細胞在維持血流通暢、抵抗血栓形成等方面發揮著關鍵作用。焦油、尼古丁作為煙草中兩種重要的有害物質，被人們廣泛研究，但罕見報道其對內皮細胞的影響。本研究擬明確煙草中焦油和尼古丁對人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖的影響，以期為進一步研究焦油、尼古丁導致血管內血栓形成的機制做出重要的前期研究。

1　材料與方法

1.1材料

Medium200培養基、低血清生長添加劑（LSGS）、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶購自美國Gibco公司，尼古丁購自美國Sigma公司；焦油由中國科學院煙草研究所惠贈；TNF-a購自以色列ProSpec公司；胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司；羊抗鼠IgG FITC抗體、BrdU抗體購自英國Abcam公司；兔抗人VIII因子相關抗原多克隆抗體、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2原代細胞培養、傳代及鑒定

由武警總醫院婦產科提供健康產婦剖宮產臍帶，從臍帶臍靜脈中分離培養原代HUVECs，第2～3代細胞用于實驗。

1.2．1原代HUVECs分離培養，參照文獻［7］方法并加以改進武警總醫院剖宮產術后，無菌條件取健康產婦的新鮮臍帶，放入盛有4℃生理鹽水的無菌燒杯中；超凈臺紫外滅菌30 min，將臍帶放在小托盤內，用無菌剪剪去兩端被鉗夾的血腫部位，生理鹽水將臍帶沖洗干凈，盡量擠凈臍帶內的殘留血凝塊；生理鹽水沖洗臍帶兩頭，于臍靜脈一端固定結扎三通管（入口），生理鹽水經三通管沖洗臍靜脈內腔；臍靜脈另一端再固定結扎三通管（出口），由三通管入口處注入37℃0.1%I型膠原酶，見出口處流出淡黃色液體后，關閉出口處三通管；繼續注入Ⅰ型膠原酶液，臍帶膨脹后，關閉入口處三通管，將臍帶放入已盛有37℃生理鹽水的無菌燒杯中，靜置消化20 min；將消化液收集至50 mL離心管中；1 000 r/pm 4℃離心10 min，加入10% FBS的內皮細胞培養基重懸，按1×105/mL的細胞密度種入25 cm2培養瓶中，37℃，5%CO2孵箱內培養；每2～3 d換液1次，5～6 d觀察細胞融合80%～90%時傳代。

1.2.2HUVECs傳代培養吸出培養瓶中培養液，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶，低倍鏡下觀察細胞皺縮變圓時，將培養瓶直立，迅速吸出胰酶；加入37℃10%FBS的內皮細胞培養基12～15 mL終止消化；輕柔吹打均勻，1∶3傳代。

1.2.3HUVECs鑒定按1×105/mL的細胞濃度傳代至6孔板內2 mL，觀察孔內細胞80%融合后棄上清，PBS漂洗3次×2 min；4%多聚甲醛固定5 min，PBS漂洗3次×5 min；3%H2O2室溫孵育5 min，PBS漂洗3次×5 min；每孔加入封閉液2 mL，室溫靜置1h；吸出封閉液，加入兔抗人Ⅷ因子多克隆抗體工作液，濕盒內4℃過夜，PBS漂洗3次×5 min；加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG，濕盒內室溫60 min，PBS漂洗3次×5 min；加入DAB顯色液，顯色5-10 min，光鏡下觀察染色效果，PBS漂洗以終止顯色；蘇木素復染，PBS漂洗3次×5 min，晾干后光鏡下攝片。

1.3實驗分組

（1）對照組：單純培養液中加入一定體積的甲醇溶液同步培養；（2）不同濃度焦油6 h組：焦油終濃度分別為50 mg/L，20 mg/L，10 mg/L，1 mg/L，共同孵育6 h；3）不同濃度焦油24 h組：焦油終濃度分別為50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、1 mg/L，共同孵育24 h；4）不同濃度尼古丁6 h組：尼古丁終濃度分別為10～3 mol/L、10～5 mol/L、10～7 mol/L、10～9 mol/L，共同孵育6 h；5）不同濃度尼古丁24 h組：尼古丁終濃度分別為10～3 mol/L、10～5 mol/L、10～7 mol/L、10～9 mol/L，共同孵育24 h。

1.4CCK-8法檢測焦油與尼古丁對HUVECs增殖的影響

HUVECs以1×105/mL細胞密度接種至96孔板，100 uL/孔；每組設5個平行孔，待分組培養結束后，每孔加入10 uL CCK-8溶液37℃，5%CO2孵箱內培養4 h，酶標儀450 nm波長測定吸光度A值，實驗重復3次。

1.5BrdU染色法檢測焦油與尼古丁對HUVEs增殖的影響

HUVECs以1×105/mL細胞密度接種至24孔板，1 mL/孔；待細胞培養至6 h及24 h后加入BrdU摻入劑（使BrdU終濃度為20μM/L），培養2 h后4%多聚甲醛固定30 min。PBS緩沖液清洗5 min×3次；2 mol/L HCl室溫處理12 min；用0.1 mol/L硼酸鈉（pH=8.5）中和12 min，并用PBS緩沖液沖洗10 min×3次；Triton-PBS緩沖液進行細胞打孔30 min；1%BSA溶液稀釋的BrdU抗體（1：100）進行一抗孵育，4℃過夜；PBS緩沖液清洗5 min×3次；加入抗鼠-Cy3二抗，于室溫條件下避光孵育2 h；PBS緩沖液清洗5 min×3次；用DAPI染料浸染細胞核，避光條件下室溫孵育15 min；PBS緩沖液清洗5 min×3次后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以Mean±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），Levene’s法檢驗多組間方差齊性，SNK-q檢驗比較多組間兩兩差異；方差不齊，用Kruskal-Wallis H檢驗比較各組間差異，Nemenyi法檢驗比較每兩組間差異。用P＜0.05表示有統計學意義。

2　結果

2.1原代HUVECs細胞形態及鑒定

成功從臍帶中分離、培養及傳代HUVECs。細胞呈多角形或者短梭形，融合為單層，核仁清晰可見（圖1A）。Ⅷ因子免疫細胞化學染色陽性，可見95%以上的內皮細胞胞漿內含有棕色顆粒，可以證實培養的細胞為內皮細胞（圖1B）。

圖1　A：原代人臍靜脈內皮細胞；B：經免疫組化染色VIII因子鑒定的人臍靜脈內皮細胞（10×10）

2.2CCK-8法檢測焦油與尼古丁對HUVECs增殖的影響

酶標儀檢測不同濃度焦油與尼古丁孵育HUVECs 6 h、24 h后對HUVECs增殖的影響，結果以吸光度A值表示，見（表1-2）。細胞培養至6 h，50 mg/L焦油組A（450）值低于對照組A（450），具有統計學意義（P＜0.05）；細胞培養至24 h，50 mg/L焦油組A（450）值低于其他各組A（450）值，具有統計學意義（P＜0.05）；而不同濃度尼古丁組6 h、24 h與對照組相比隨濃度的升高，A（450）值呈現逐漸升高的趨勢，但無統計學意義（表1-2）。

表1　不同濃度焦油對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響（±s，n=15）

表1　不同濃度焦油對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響（±s，n=15）

注：與對照組比，△P＜0.05；與50 mg/L焦油組比，*P＜0.05。

組別對照組1 mg/L焦油組10 mg/L焦油組20 mg/L焦油組50 mg/L焦油組CCK-8（A450）6 h 24 h 1.281±0.120 1.235±0.102 1.165±0.109 1.163±0.145 1.135±0.138△1.373±0.127 1.328±0.157* 1.319±0.122* 1.270±0.198* 1.058±0.124△

2.3BrdU染色檢測焦油與尼古丁對HUVECs增殖的影響

BrdU陽性染色檢測不同濃度焦油與尼古丁孵育HUVECs 6 h、24 h后對HUVECs增殖的影響，結果如圖2所示。細胞培養至6 h，各焦油組BrdU陽性率與對照組相比沒有統計學意義；細胞培養至24 h，50 mg/L焦油組BrdU陽性率低于其他各組，具有統計學意義（P＜0.05）；不同濃度尼古丁組6 h、24 h與對照組相比，BrdU陽性率無統計學意義。

表2　不同濃度尼古丁對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響（±s，n=15）

表2　不同濃度尼古丁對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響（±s，n=15）

組別對照組10-9 mol/L尼古丁組10-7 mol/L尼古丁組10-5 mol/L尼古丁組10-3 mol/L尼古丁組CCK-8（A450）6 h 24 h 1.197±0.109 1.182±0.121 1.213±0.103 1.273±0.114 1.312±0.098 1.247±0.139 1.292±0.120 1.321±0.175 1.345±0.107 1.371±0.109

3　討論

吸煙是心血管疾病的重要危險因素。研究發現急性冠脈綜合征患者術后發生支架內血栓的幾率吸煙者明顯大于不吸煙者［8］。這引起了研究者們對煙草中重要成分：焦油及尼古丁，與心血管疾病之間關系的探究興趣。焦油、尼古丁作為煙草中兩種重要的有害物質被人們廣泛研究，它們在誘發各種機體反應中起著十分重要的作用，不僅可以激活血管NADH/NADPH氧化酶系統、活化炎性細胞、改變抗氧化酶系統的活性、減少NO的產生并降低其生物活性、增加血液中內皮素含量，而且還能調控細胞凋亡與增殖［9］。本研究通過BrdU染色實驗顯示細胞培養6 h，50 mg/L焦油組與對照組相比無統計學意義，細胞培養24 h，1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L組與對照組沒有統計學意義，這與CCK-8實驗不一致，但能觀察出隨著焦油濃度的升高其抑制內皮細胞增殖的趨勢越明顯。CCK-8實驗是通過WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物，顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450 mm波長處測定OD值，間接反映活細胞數量，而BrdU陽性細胞則是直接代表細胞的增殖情況，所以50mg/L焦油組抑制臍靜脈內皮細胞的增殖。

圖2　A：不同濃度焦油組HUVECs的BrdU染色；B：不同濃度尼古丁組HUVECs的BrdU染色（標尺：80 um）；C：不同濃度焦油組BrdU染色陽性率比較；D：不同濃度尼古丁組BrdU染色陽性率比較。

既往研究［10］也發現焦油中有害成分可以明顯使內皮細胞損傷甚至死亡，這可能是吸煙導致血管內血栓形成的機制之一。本研究還觀察到隨著尼古丁濃度的升高其增加內皮細胞增殖的趨勢越明顯。以往研究［11］報道在對內皮細胞急性刺激干預6 h，尼古丁可增加內皮細胞增殖，抑制內皮細胞凋亡，其研究觀察到尼古丁急性刺激干預可上調內皮細胞氮氧合酶（eNOS）的表達，升高局部NO濃度，進而促進其增殖，但其損害內皮細胞的功能，同樣可導致血管內血栓的形成，這與本研究結果一致。現有的抗血栓治療主要針對血栓形成過程的干預［12］，期待開發保護內皮功能等藥物的研制，從血栓形成的上游因素阻礙血栓的形成。

另外，本研究因為選用的最長時間僅24 h，所以只是研究了焦油、尼古丁短時間內對內皮細胞增殖的作用效果，并未研究其慢性暴露后的可能變化，這是本研究的局限性之一，期待進一步研究證實焦油、尼古丁對內皮細胞長期作用的影響，并且進一步闡明其可能機制及其下游效應。

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（本文編輯李杰）

Study of Cigarette Tar and Nicotine w ith Different Concentrations on the Proliferation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells

WU Yujing1，2，ZHANG Jing3*，LAI Bin1，LI Yi1，WEI Yujie1，LIU Huiliang1*
（1.General Hospital of the Chinese People's Armed Police Forces，Beijing 100039，China；2.Logistics University of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin 300309，China；3.Medical Department，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R285

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.06.007

2016-03-10

國家自然科學基金資助項目（81370315）。

吳雨徑，女，在讀碩士研究生，研究方向：冠心病的防治。

*劉惠亮，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，E-mail：lhl518@vip.sina.com；張晶，男，醫師，E-mail：86413123@qq.com。