五汁飲對急性酒精中毒大鼠肝臟的保護(hù)機(jī)制研究

謝夢洲，馮楚雄，朱建平，瞿昊宇，肖作為*，向茗，吳玉冰

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410208；3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410208；4.數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410208）

五汁飲對急性酒精中毒大鼠肝臟的保護(hù)機(jī)制研究

謝夢洲1，2，3，4，馮楚雄1，2，3，朱建平1，2，3，瞿昊宇1，2，3，4，肖作為3*，向茗1，2，3，吳玉冰3

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410208；3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410208；4.數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410208）

目的研究五汁飲對急性酒精中毒大鼠肝臟的保護(hù)作用。方法SD大鼠分為5組，分別為空白組、模型組、葛花組、五汁飲低劑量組及高劑量組，每組10只。預(yù)防性給藥7 d后，空白組蒸餾水灌胃，其余各組按照1.5 mL/100 g的52度紅星二鍋頭給予灌胃，每日1次，連續(xù)1周，建立急性酒精性肝損傷模型。測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量；測定肝臟勻漿中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乙醇脫氫酶（ADH）含量。結(jié)果與模型組相比，葛花組、五汁飲高劑量組ALT含量降低（P＜0.05），五汁飲高、低劑量組AST含量降低（P＜0.01）；五汁飲高劑量組ADH含量高于模型組（P＜0.05），葛花組、五汁飲低劑量組與模型組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；葛花組、五汁飲高、低劑量組GSH、SOD含量高于模型組（P＜0.01，P＜0.05），葛花組、五汁飲高、低劑量組均可顯著降低MDA含量（P＜0.01）。結(jié)論五汁飲保肝作用可能通過激活A(yù)DH加快酒精代謝及SOD、GSH的抗氧化作用來實(shí)現(xiàn)。

酒精性肝損傷；五汁飲；抗氧化；乙醇脫氫酶

〔Abstract〕Objective To study the effect of Wuzhiyin on the liver of rats with acute alcoholism.Methods SD rats were divided into 5 groups：blank group，model group，Gehua group，low dose group and high dose group of Wuzhiyin，10 rats in each group.After 7days preventive administration，the blank group was given a gavage of distilled water and the remaining groups were treated with 1.5 mL/100 g 52%alcohol，once a day for one week，and the model of acute alcoholic liver injury was established.The content of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）were detected and the content of liver homogenate glutathione（GSH），superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA），alcohol dehydrogenase（ADH）were also detected.Results Compared with the model group，the content of ALT in Gehua group and high dose Wuzhiyin group was decreased（P＜0.05）.The content of AST in high and low dose of Wuzhiyin group was reduced（P＜0.01）.The content of ADH in the high dose Wuzhiyin group was higher than the model group（P＜0.05），and there was no significant difference between themodel group and the low dose group of Wuzhiyin（P＞0.05）.The content of GSH and SOD in Gehua group，high and low dose of groups was higher than that in model group（P＜0.01，P＜0.05）.The content of MDA in Gehua group，the high and low dose of Wuzhiyin groups was significantly decreased（P＜0.01）.Conclusion The hepatoprotective effect of Wuzhiyin was possibly through activation of ADH to accelerate themetabolism of alcohol and antioxidant.

〔Keywords〕alcoholic liver injury；Wuzhiyin；antioxidant；alcohol dehydrogenase

酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損傷的第二大病因，酒精性肝病是導(dǎo)致肝硬化的主要病因［1-2］。酒精對肝的損傷主要是其代謝產(chǎn)物乙醛引起的，乙醛易在肝中堆積，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、炎性細(xì)胞因子釋放［3］，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生膠原導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化［4］。

五汁飲出自吳鞠通《溫病條辨》，由鮮梨汁、鮮荸薺汁、鮮蘆根汁、鮮麥冬汁和鮮藕汁組成，具有清熱養(yǎng)陰、生津止渴的功效。研究表明：梨肉中富含酚類物質(zhì)綠原酸和表兒茶素，具有良好的抗氧化作用［5］；荸薺富含硒、黃酮、多酚等抗氧化物質(zhì)，具有抗氧化、抗癌的作用［6］；蘆根中的多糖成分具有抗氧化、抗自由基作用，并通過抗氧化作用保護(hù)肝細(xì)胞、抑制膠原沉積等途徑來抑制肝纖維化，改善肝功能，降低肝脂肪化［7-8］；麥冬富含多糖、皂苷及黃酮類成分，其中麥冬多糖具有抗炎、抗心肌缺血、耐缺氧、抗過敏、抗氧化作用［9-10］；蓮藕中的多糖物質(zhì)具有降血糖作用，可提升體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）的活性，減少丙二醛（MDA）的生成［11］。由此可見，五汁飲的組成成分均具有良好的抗氧化、抗自由基作用。目前，五汁飲保肝作用研究甚少，本文通過測定大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及肝臟組織中MDA、谷胱甘肽（GSH）、SOD、乙醇脫氫酶（ADH）等的變化，研究五汁飲對急性酒精中毒大鼠肝臟的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1動物

SPF級SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證號：SYXK2013（湘）江-0005。

1.2藥物

五汁飲：梨200 g、荸薺500 g、藕500 g、蘆根50 g、麥冬25 g。梨、荸薺、蓮藕洗凈去皮，榨汁。蘆根、麥冬放入鍋內(nèi)，加入2 L水，置大火上燒沸5 min后，改小火煮30 min，過濾，合并梨汁、荸薺汁、藕汁，過濾，濾液濃縮為2.0 g生藥/mL濃縮液，密封，放入4℃冷藏。

陽性對照藥葛花濃縮液：取葛花50 g，加入500 mL水，置大火上燒沸，改小火煮10 min，過濾，重復(fù)煎煮1次，合并兩次濾液，將濾液濃縮為0.5 g生藥/mL濃縮液，密封，放入4℃冷藏。

1.3主要儀器

UV-2600型紫外可見分光光度儀（上海儀器有限公司），水浴鍋（深圳市江承儀器有限公司），低溫高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），內(nèi)切式組織勻漿機(jī)（寧波新芝科研儀器研究所），漩渦震蕩器（寧波新芝科研儀器研究所），電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

1.4主要試劑

52℃紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司生產(chǎn)，批號：20141104），生理鹽水（廣東艾希德藥業(yè)有限公司，批號：141219201），水合氯醛（天津市大茂化工試劑廠，批號：20140823），乙醇脫氫酶（ADH）測定試劑盒（南京建成生物研究所，批號：20141113），總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒（南京建成生物研究所，批號：20141118），丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物研究所，批號：20141123），還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（南京建成生物研究所，批號：20141015），蛋白定量測試盒（南京建成生物研究所，批號：20140905）。

1.5動物分組與處理

實(shí)驗(yàn)動物按照隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對照組、模型組、五汁飲低劑量組、五汁飲高劑量組、葛花組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，各組大鼠禁食10 h，不禁水，預(yù)防性給藥7 d：空白組、模型組給予蒸餾水灌胃，五汁飲低劑量組、高劑量組以五汁飲灌胃，給藥劑量分別為23.0 g/kg、46.0 g/kg，葛花組給予葛花水煎液0.15 g/kg。各組給藥容量為10 mL/kg。給藥30 min后，空白對照組予以蒸餾水灌胃，其余各組按照1.5 mL/100 g52℃紅星二鍋頭給予灌胃，每天1次，連續(xù)1周。末次給藥2 h后進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.6標(biāo)本采集

用10%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，腹主動脈取血，靜置，3 000 r/min離心，取血清，送至湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢測ALT、AST。取血后處死動物，在肝左葉取部分肝組織，準(zhǔn)確稱取肝臟0.5 g，按照重量體積比（g∶mL）1∶9的比例加入生理鹽水，制備成10%的勻漿，離心后取上清液，按照試劑盒說明書測ADH、SOD、MDA、GSH的含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件包處理統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用“±s”表示，并在滿足正態(tài)分布和方差齊性基礎(chǔ)上，多組間均數(shù)比較采單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況觀察

正常組大鼠毛色有光澤，靈活好動，針刺刺激四肢末端反應(yīng)靈敏，大小便正常。模型組在灌胃白酒后出現(xiàn)身體癱軟，步姿不穩(wěn)，后腹拖地爬行，活動減少的現(xiàn)象，針刺刺激四肢末端反應(yīng)不靈敏，嚴(yán)重者翻正反射消失。隨著灌胃次數(shù)增多，模型組出現(xiàn)食欲下降、飲食減少、毛色晦暗或變黃、毛發(fā)凌亂、大便溏瀉且異味較重、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。葛花組、五汁飲高、低劑量組大鼠灌胃后反應(yīng)不明顯，偶見大鼠出現(xiàn)身體癱軟、步姿改變、活動量減少的現(xiàn)象。

2.2各組大鼠ALT、AST含量測定結(jié)果

與空白組比較分析，模型組ALT、AST的含量顯著升高（P＜0.01，P＜0.01），提示酒精對肝臟具有損傷作用。與模型組比較分析，葛花組、五汁飲高劑量組ALT含量顯著降低（P＜0.05），五汁飲高、低劑量組AST顯著降低（P＜0.01）。提示五汁飲具有改善肝功能的作用。見表1。

表1　各組大鼠血清中ALT、AST含量結(jié)果表（±s，U/L）

表1　各組大鼠血清中ALT、AST含量結(jié)果表（±s，U/L）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組葛花組五汁飲高劑量組五汁飲低劑量組F值P值n 10 10 10 10 10 --ALT 31.40±10.16 70.90±25.66** 53.22±17.27*#53.90±17.13**#60.40±19.33** 7.116 P＜0.01 AST 136.00±16.81 242.30±42.12** 200.30±38.65**#154.40±34.14##192.60±49.62**##12.59 P＜0.01

2.3各組大鼠肝臟勻漿ADH含量測定結(jié)果

與空白組進(jìn)行對比分析，模型組ADH含量增加（P＜0.05），葛花組、五汁飲高、低劑量組含量顯著增加（P＜0.01），各組的ADH含量都不同水平的增加，提示喝酒能激活A(yù)DH的表達(dá)。與模型組比較分析，五汁飲高劑量組ADH含量高于模型組（P＜0.05），而葛花組、五汁飲低劑量組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示五汁飲高劑量組比葛花組、五汁飲低劑量組更能有效地激活A(yù)DH表達(dá)，從而促進(jìn)肝臟中乙醇的分解代謝。見表2。

表2　大鼠肝臟勻漿中ADH的含量（±s，U/mgprot）

表2　大鼠肝臟勻漿中ADH的含量（±s，U/mgprot）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05。

組別空白組模型組葛花組五汁飲高劑量組五汁飲低劑量組F值P值n 10 10 10 10 10 --ADH 5.77±2.50 9.06±2.09* 9.99±2.77** 12.38±4.28**#10.64±3.64** 5.812 P＜0.01

2.4各組大鼠肝臟勻漿中GSH、SOD、MDA含量測定結(jié)果

與空白組對比，模型組GSH、SOD含量低于空白組（P＜0.01，P＜0.05），MDA含量高于空白組（P＜0.01），葛花組、五汁飲高、低劑量組的GSH、SOD、MDA含量與空白組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示模型組體內(nèi)具有氧化損傷。與模型組對比，葛花組GSH、SOD含量高于模型組（P＜0.01，P＜0.05），五汁飲高、低劑量組均能顯著提高GSH、SOD含量（P＜0.01），葛花組、五汁飲高、低劑量組均可顯著降低MDA含量（P＜0.01），提示葛花、五汁飲能提升體內(nèi)抗氧化水平。見表3。

表3　大鼠肝臟勻漿中GSH、SOD、MDA含量（n=10，±s）

表3　大鼠肝臟勻漿中GSH、SOD、MDA含量（n=10，±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組葛花組五汁飲高劑量組五汁飲低劑量組F值P值GSH（μmol/L）11.27±2.11 6.21±2.16** 11.74±4.53##13.52±3.66##12.51±4.51##6.254 P＜0.01 SOD（U/mgprot）142.81±60.13 89.44±44.87* 145.53±49.98#157.39±49.29##157.08±68.45##2.590 P＜0.05 MDA（nmol/mgprot）1.23±0.41 2.07±0.35** 1.24±2.56##1.42±0.37##1.51±0.41##6.423 P＜0.01

3　討論

AST、ALT是存在于肝臟中重要的轉(zhuǎn)氨酶，臨床上用于檢查肝功能，其數(shù)值的高低可反映肝臟是否受到損害，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷，出現(xiàn)炎癥、壞死時，肝中的ALT、AST就會釋放到血液中，使血液中ALT、AST的水平升高［12-13］。一般認(rèn)為，ALT比AST更能靈敏地反映肝臟是否有損傷，一旦肝臟存在損傷，ALT水平會升高，而肝臟損傷到一定程度，才會引起AST升高。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠以52度紅星二鍋頭灌胃后，各組的ALT水平均高于空白組，除五汁飲高劑量組外，其余各組AST水平均高于空白組，說明酒精對肝臟具有損傷作用急性酒精性肝損傷模型制備成功。與模型組進(jìn)行比較分析可知，五汁飲都降低ALT、AST水平，且高劑量降低效果更加突出，說明五汁飲可以對抗酒精對肝臟的損傷，減少肝臟的炎癥反應(yīng)，具有改善肝功能，保護(hù)肝臟的作用。

MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，MDA水平的高低可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度以及細(xì)胞受自由基攻擊的程度的高低。機(jī)體SOD、GSH水平的高低，反映機(jī)體抗氧化抗自由基能力的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)中，模型組的GSH、SOD水平降低，而MDA水平升高，說明攝入酒精后體內(nèi)出現(xiàn)氧化損傷，自由基增多，脂質(zhì)過氧化物增多，SOD、GSH在抗氧化、抗自由基的過程中損耗多，因而處于低水平狀態(tài)。五汁飲高低劑量組SOD、GSH水平升高，MDA水平降低，說明五汁飲能提升體內(nèi)抗氧化能力，具有良好的抗氧化、抗自由基、減少脂質(zhì)過氧化的作用。

五汁飲有清熱養(yǎng)陰生津的功效，江凌圳等［14］運(yùn)用大腸桿菌內(nèi)毒素制備高熱傷陰動物模型探究五汁飲清熱養(yǎng)陰，生津的藥理學(xué)依據(jù)，發(fā)現(xiàn)五汁飲具有良好的解熱作用，并能拮抗內(nèi)毒素所致紅細(xì)胞膜ATP酶活力降低，減輕發(fā)熱動物傷津、傷陰的程度。五汁飲在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中有新的運(yùn)用，臨床上以五汁飲為主方進(jìn)行加減，運(yùn)用食療的方法治療痤瘡、小兒暑熱癥［15］。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)五汁飲具有良好的解酒、保肝護(hù)胃的作用，可降低大鼠酒后血中乙醇的濃度［16］，減少急性酒精性肝、胃的病理損傷［17］。

目前認(rèn)為急性酒精性肝損傷是乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛引起的。乙醇不僅能損害線粒體的功能，還能使線粒體MDA增加，GSH水平下降，線粒體形態(tài)異常；乙醛可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜，促進(jìn)肝損傷，從而使肝細(xì)胞受損［18］。本實(shí)驗(yàn)中，五汁飲通過提高ADH活性，加快酒精代謝，并通過SOD、GSH的抗氧化、抗自由作用，降低脂質(zhì)過氧化，減少自由基對機(jī)體的損傷，從而起到保肝、護(hù)肝的作用。

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（本文編輯匡靜之）

The Protective M echanism of W uzhiyin on the Liver of Rats W ith Acute Alcoholism

XIE Mengzhou1，2，3，4，F(xiàn)ENG Chuxiong1，2，3，ZHU Jianping1，2，3，QU Haoyu1，2，3，4，XIAO Zuowei3*，XIANG Ming1，2，3，WU Yubing3
（1.Institute of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Hunan Province Key Laboratory of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；3.Hunan Engineering Research Center of Medicine and Food Homology Functional Food，Changsha，Hunan 410208，China；4.Collaborative Innovation Center of Digital Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R585.5；R575.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.06.013

2016-03-24

湖南省教育廳創(chuàng)新平臺基金資助（12k083）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科開放基金資助（2014-27）。

謝夢洲，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：常見疾病中醫(yī)藥膳防治。

*肖作為，男，講師，E-mail：574512660@qq.com。