益氣養陰方對2型糖尿病大鼠肝臟糖代謝紊亂的調節作用

劉碧原　趙靜　劉進娜　謝鳴

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益氣養陰方對2型糖尿病大鼠肝臟糖代謝紊亂的調節作用

劉碧原趙靜劉進娜謝鳴

目的探查益氣養陰方對氣陰兩虛2型糖尿病型大鼠肝臟糖代謝紊亂的調節機制。 方法雄性SD大鼠隨機分為正常組10只和造模組45 只。其中正常組給予基礎飼料喂養；模型組給予高脂高糖飼料喂養。第6周，造模組大鼠給予一次性腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素，并于實驗第6周末，選擇空腹血糖≥11.1mmol/L的造模組大鼠隨機分為模型組、中藥組、西藥組，每組10只；中藥組給予益氣養陰方[4.80 g/(kg·d)]，西藥組給予鹽酸吡格列酮[1.35 g/(kg·d)]，正常組和模型組分別以等量蒸餾水灌胃，連續給藥兩周。給藥后，檢測2型糖尿病氣陰兩虛證、肝臟胰島素抵抗、肝臟糖代謝相關指標。 結果與正常組相比，模型組大鼠血中血糖(fasting plasma glucose，FPG)、血清胰島素(fasting serum insulin，Fins)、胰島素抵抗指數(insulin resistance index，IRI)、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)、肝臟磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthasc kinase-3，GSK-3)均明顯升高(P<0.01)；大鼠血中環磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)、cAMP/cGMP和紅細胞膜Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)，肝臟胰島素受體(Insulin receptor，InsR)和胰島素受體底物2(insulin receptor substrate，IRS-2)、肝糖原含量均明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，中藥組和西藥組大鼠FPG、IRI、肝臟PEPCK、GSK-3明顯降低(P<0.05或P<0.01)，并且中藥組血中Fins、cGMP、G-6-P下降，cAMP、cAMP/cGMP、紅細胞膜Na+-K+-ATPase、IRS-1和肝糖原含量均明顯上升(P<0.05或P<0.01)。與西藥組相比，中藥組大鼠血中cGMP降低，cAMP、cAMP/cGMP和紅細胞膜Na+-K+-ATPase均升高(P<0.01)。 結論益氣養陰方對2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠的肝臟糖代謝有改善作用，其機制與胰島素受體和糖代謝相關酶的調節有關。

益氣養陰方；2型糖尿病；肝臟；糖代謝

“方證相關”是方劑學中的重要原理，方劑的功效或作用與其所作用對象密切相關[1]，因此在中醫方劑的藥理探查中，應充分考慮到其適宜病證模型的選擇。前期的研究曾發現，采用高脂高糖喂養聯合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)注射復制的2型糖尿病大鼠模型在早期表現為中醫氣陰兩虛證[2]，中醫益氣養陰方對該模型具有一定防治作用[3-4]。2型糖尿病的主要病理生理基礎是胰島素抵抗(insulin resrstamce,IR)，并貫穿疾病始終，其中肝臟作為胰島素抵抗的主要靶器官之一，在胰島素抵抗中了發揮重要作用[5]。本文基于“方證相關”的理論，選擇2型糖尿病氣陰兩虛證大鼠模型，進一步探查益氣養陰方對該模型大鼠肝臟糖代謝紊亂的調節作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物

選取SPF級健康雄性SD大鼠55只，體質量(190±10)g，動物許可證號為：SCXK(京)2011-0004，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供。所有動物提前1周購入，6只/籠。光照節律,室溫及濕度正常，并保持安靜。

普通飼料許可證號：SCXK(京)2009-0012(生產批號：13103212)；高脂高糖飼料由2%膽固醇、0.5%牛膽酸鈉、10%豬油、5%蔗糖、5%蛋黃粉、77.5%基礎飼料復合而成，等級：A級，許可證號：SCXK(京)2014-0010。以上飼料均由北京科澳協力飼料有限公司加工提供。

1.2實驗藥物

益氣養陰方及其顆粒制備：處方由黃芪15 g、生地黃12 g、山藥10 g、山茱萸10 g、麥冬10 g組成。方中山藥打成細粉，余藥加水浸泡2小時，煎煮提取3次，每次1小時，加水量分別為10倍、8倍、8倍，濾過；合并3次濾液，減壓濃縮(溫度≤70℃)，干燥(溫度≤70℃)，得干膏(出膏率為65.76%)；加入山藥粉，混勻，加95%乙醇制成軟材，14目篩制粒，干燥(溫度≤70℃)，12目篩整粒，得干顆粒(1.578 g生藥/g顆粒)。制劑制備在北京中醫藥大學中試車間完成。

西藥鹽酸吡格列酮片(15 mg×7/板/盒，日本武田藥品工業株式會社生產，天津武田藥品有限公司分裝，生產批號：130406)。

1.3實驗試劑和儀器

鏈脲佐菌素(批號：WXBB2432V)，購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司；檸檬酸三鈉(批號：1307202、1303262)，購自西隴化工股份有限公司；大鼠環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)酶聯免疫試劑盒(批號：20150420.60320R)、大鼠環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)酶聯免疫試劑盒(批號：20150420.60161R)、超微量Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)測定試劑盒(批號：20150115.40041R)、大鼠肝臟胰島素受體(insulin receptor，InsR)數量酶聯免疫試劑盒(批號：20150422)、大鼠胰島素受體底物1(IRS-1)酶聯免疫試劑盒(批號：20150920.60386R)、IRS-2酶聯免疫試劑盒(批號：20150928. 60387R)、大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)酶聯免疫試劑盒(批號：20150920.60435R)、大鼠葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)酶聯免疫試劑盒(批號：20150420.60328R)、大鼠肝糖原酶聯免疫試劑盒(批號：20150420.60354R)、大鼠糖原合成酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3，GSK-3)酶聯免疫試劑盒(批號：20150420.60366R)，均由北京瑞格博科技發展有限公司提供。血糖試紙：Ultra穩豪(批號：3569812)，購自強生(中國)醫療器材有限公司。

釆血針(注式soft2型，批號：01-121276)，購自蘇州施萊醫療器械有限公司；血糖儀(Ultra Easy型，批號：R1288052X)，購自強生(中國)醫療器材有限公司；電子天平(PL6001-S型)，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；離心機(Sigma3K30型)，購自Sigma公司；生化儀(UniCel DxC 600 Synchron型)，購自Beckman Coulter公司；酶標儀(Thermo Multiskan MK3型)，購自Thermo Scientific芬蘭雷勃公司。

1.4試劑制備

0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液：稱取2.1 g檸檬酸，溶于100 mL去離子水中，配成0.1 mol/L檸檬酸溶液A；稱取2.94 g檸檬酸三鈉，溶于100 mL去離子水中，配成0.1 mol/L檸檬酸三鈉溶液B；按A液∶B液=1∶1.2比例混合配成檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，高溫高壓滅菌15分鐘，4℃冷藏備用。

STZ溶液：稱取一定量的STZ，用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液配制成1%的濃度，調pH值至4.20，避光在冰浴中操作。

1.5造模方法

參照文獻[6]，給予造模大鼠高脂高糖飼料，連續5周。第6周時，造模組大鼠給予一次性腹腔注射30 mg/kg STZ，正常組注射同劑量0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，注射第三天，尾靜脈釆血檢測大鼠空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L為成模標準。

1.6給藥方法

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組10只和造模組45只。其中正常組大鼠給予基礎飼料喂養，造模組按上述方法造模，剔除空腹血糖<11.1 mmol/L的大鼠，將符合模型標準的大鼠繼續給予高脂高糖飼料喂養至實驗第8周末。于實驗第6周末開始，將造模組成模大鼠隨機分為模型組、中藥組、西藥組，共3組，每組10只，其中中藥組和西藥組分別予以益氣養陰方，濃度為4.80 g/(kg·d)和鹽酸吡格列酮，濃度為1.35 g/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，連續給藥兩周。于第8周末，大鼠禁食12小時后，乙醚麻醉，腹主動脈采血，抗凝管中的全血立即用Na+-K+-ATP酶試劑盒進行檢測；非抗凝管中血樣于室溫靜置1小時后，3000 rpm離心15分鐘，取血清；新鮮肝臟組織液氮迅速冷凍后，放入-80℃冰箱中保存待測。

1.7觀測指標

(1)病證模型：血糖(fasting plasma glucose，FPG)，試紙測定；(2)血清胰島素(fasting serum insulin，Fins)、cAMP、cGMP，ELISA法；(3)紅細胞膜Na+-K+-ATPase，生化法；(4)胰島素抵抗指數(IRI)：IRI=FPG*Fins/22.5；(5)胰島素受體及底物：肝臟InsR、IRS-1、IRS-2，ELISA法；(5)肝糖代謝：PEPCK、G-6-P、GSK-3、糖原，ELISA法。

1.8統計學處理

2　結果

2.1益氣養陰方對模型病證關聯指標的影響

與正常組相比，模型組大鼠FPG、Fins及IRI均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，中藥組和西藥組大鼠FPG、IRI均明顯下降(P<0.05、P<0.01)；并且中藥組Fins下降明顯(P<0.01)。見表1。

表1　益氣養陰方對模型大鼠2型糖尿病相關指標的影響±s)

注： 與正常組比較，aP<0.01； 與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05。

與正常組相比，模型組大鼠血中cAMP下降，cGMP升高，cAMP/cGMP和紅細胞膜Na+-K+-ATPase均明顯下降(P<0.01)。與模型組相比，中藥組大鼠血中cAMP升高，cGMP降低，cAMP/cGMP、紅細胞膜Na+-K+-ATPase均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；西藥組cAMP、cGMP、cAMP/cGMP、Na+-K+-ATPase均未見明顯差異。與中藥組相比，西藥組大鼠血中cAMP下降、cGMP升高、cAMP/cGMP和紅細胞膜Na+-K+-ATPase均降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2　益氣養陰方對模型大鼠氣陰兩虛證相關指標的影響±s)

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與中藥組比較，cP<0.01。

表3　益氣養陰方對模型大鼠肝臟胰島素受體關聯指標的影響±s)

注： 與正常組比較，aP<0.01，bP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表4　益氣養陰方對模型大鼠肝臟糖代謝相關指標的影響±s)

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05；剔除了離散度較大的數據，故每組只有8只。

2.2益氣養陰方對模型大鼠肝臟胰島素受體相關指標的影響

與正常組相比，模型大鼠肝臟InsR和IRS-2均明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05、P<0.01)；IRS-1未見明顯變化(P>0.05)。與模型組相比，中藥組和西藥組大鼠的InsR和IRS-2均呈不同程度的增加，但差異均無統計學意義(P>0.05)；中藥組IRS-1有所增加(P<0.05)；與中藥組相比，西藥組大鼠的InsR、IRS-1和IRS-2水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.3益氣養陰方對模型大鼠肝臟糖代謝相關指標的影響

與正常組相比，模型組大鼠肝臟PEPCK、G-6-P、GSK-3均升高，肝糖原降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比，中藥組和西藥組大鼠肝臟PEPCK、GSK-3均見降低，中藥組G-6-P降低、糖原升高(P<0.05、P<0.01)；與中藥組相比，西藥組大鼠肝臟PEPCK、G-6-P、GSK-3及糖原水平未見明顯差異(P>0.05)。見表4。

3　討論

2型糖尿病是一種多基因遺傳、環境因素綜合作用的內分泌代謝疾病，其確切的病因和發病機制尚未完全明了，臨床表現常以多飲、多食、多尿、高血糖及高胰島素血癥為主要特征，胰島素抵抗和胰島β細胞功能缺陷是2型糖尿病發病的兩個重要病理環節[7]。

氣陰兩虛證是2型糖尿病中醫臨床辨證的重要證型之一[8]，研究提示中醫陰陽失調主要表現在cAMP/cGMP比值的變化[9]，2型糖尿病陰虛內熱證模型大鼠 cAMP/cGMP比值明顯升高[10]，臨床2型糖尿病氣陰兩虛證患者紅細胞膜Na+-K+-ATP酶含量降低[11]和血漿cAMP 的升高[12]，提示cAMP/cGMP和Na+-K+-ATP酶的異常是2型糖尿病氣陰兩虛證的重要指標。本實驗再次觀察到該模型大鼠不僅出現血糖、血清胰島素及IR指數的明顯升高，而且還伴有血中cAMP/cGMP和紅細胞膜Na+-K+-ATP酶含量的減低，結合之前觀察到的該模型大鼠出現食量、飲水量及尿量增多、體重減輕、少動及抓握力減低等外觀表征[13]，判斷該模型是一個2型糖尿病中醫氣陰兩虛證模型。實驗中的益氣養陰方可以明顯降低模型大鼠血糖、血清胰島素水平，并能升高血中cAMP/cGMP比值及紅細胞膜Na+-K+-ATP酶的含量，顯示其對2型糖尿病氣陰兩虛證的綜合治療作用。

IR是指組織對胰島素的敏感性下降，表現為胰島素所介導的相關生物學功能的異常。IRS作為一種船塢蛋白，為胰島素的信號轉導蛋白提供了高親和力的結合位點，是胰島素發揮作用的重要環節。其中IRS-1在脂肪、肝臟、骨骼肌等均有分布，IRS-2則主要在肝臟中表達[14]。肝臟在胰島素抵抗狀態下，胰島素受體與IRS-1/2的數量減少，結合能力下降， IRS下游的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)磷酸化水平減低，胰島素信號經PI3K通路轉導減弱，進而引起肝臟糖代謝紊亂而致血糖升高[15]。

肝臟糖原異生和糖原合成/分解是維持機體血糖水平的兩個主要代謝途徑，其中一些關鍵限速酶發揮了重要的調節作用。GSK-3通過使糖原合成酶磷酸化而抑制其活性，使糖原合成減少；PEPCK是肝糖異生的限速酶，其活性升高使糖異生增強；G-6-P則是糖原分解和糖異生最后一步反應的酶，其活性升高可使肝臟糖異生增強和葡萄糖輸出增加。肝臟糖原合成減少和糖異生增強被認為是導致2型糖尿病血糖升高的主因[16]。研究發現，2型糖尿病模型大鼠肝臟GSK-3增多[17]，PEPCK和G-6-P的mRNA的表達增加[18]。

本次實驗結果顯示，該模型大鼠血糖和胰島素水平升高，肝臟胰島素受體數量及IRS-2水平下降，同時肝臟糖原含量減少，且伴有GSK-3、PEPCK和G-6-P水平的明顯升高，表明該模型大鼠的肝臟出現胰島素抵抗和糖代謝調節紊亂。益氣養陰方能降低肝臟GSK-3、PEPCK和G-6-P水平，并增加肝臟糖原的合成，表明其對肝臟糖代謝中關鍵酶具有調節作用。同時，實驗中模型大鼠肝臟胰島素受體數量及IRS-2明顯減少，而中藥和西藥兩組對其僅顯示升高作用趨勢，其中中藥組對大鼠肝臟IRS-1卻有明顯升高作用，提示西藥的干預效應與其胰島素受體作用關系不大，而益氣養陰方則可能通過增加胰島素受體及IRS-1的水平及調節糖代謝關鍵酶等多種途徑，改善胰島素抵抗而發揮其防治作用。

益氣養陰方對于2型糖尿病模型中醫氣陰兩虛證具有顯著的治療作用，較之于西藥吡格列酮，其對于血糖、血清胰島素及胰島素抵抗指數、血中cAMP/cGMP和紅細胞膜Na+-K+-ATPase酶等指標具有更明顯的改善作用，提示其在治療2型糖尿病氣陰兩虛證方面具有某種優勢。上述結果為中醫辨證(因證選方)防治2型糖尿病的經驗提供了一定的實驗證據。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effects ofYiqiYangyinformula on hepatic glucose metabolism disorder in type2 diabetes rat

LIUBi-yuan，ZHAOJing，LIUJin-na，etal.

FormularyDepartment,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029，China

XIEMing，E-mail：xieming603@263.net

ObjectiveTo discuss the mechanism ofYiqiYangyinformula on regulating the disorder of liver glucose metabolism in type2 diabetes model rats. MethodsHealthy male SD rats were randomly divided into normal group(group 1, 10 rats) and model group(45 rats). The normal group were given basic diet; the model group was given high-fat and high-sugar diet. At the 6th week of experiment, the model group were intraperitoneal injection with 30 mg/kg STZ, and then randomly divided into model group (group 2), TCM group(group 3) and western medicine group(group 4), 10 rats in each group. Group 3 were given theYiqiYangyinformula[4.80 g/(kg·d)], and group 4 were given pioglitazone hydrochloride [1.35 g/(kg·d)], the normal group and model group were given the same amount of distilled water, the treatment was lasted for two weeks. The indicators associated with the deficiency of both qi and yin, hepatic insulin resistance and liver glucose metabolism on type 2 diabetes wer observed. ResultsCompared with group 1, FPG, Fins, IRI, blood cGMP, liver PEPCK, G-6-P, GSK-3 of group 2 were significantly increased (P<0.01); the cAMP, cAMP/cGMP and Na+-K+-ATPase in blood, the liver InsR，IRS-2 and glycogen content was significantly decreased (P<0.05,P<0.01). Compared with the group 2, the FPG, IRI in blood and PEPCK, GSK-3 in liver of group 3 and group 4 were significantly decreased (P<0.05 orP<0.01); the Fins, cGMP in blood and G-6-P in liver of group 3 was decreased，but the level of cAMP , cAMP / cGMP and Na+-K+-ATPase in blood, IRS-1, glycogen in liver were significantly increased (P<0.05,P<0.01); Compared with group 4, the cGMP was decreased, but the cAMP, cAMP/cGMP and Na+-K+-ATPase were increased (P<0.05,P<0.01) of the group3.ConclusionTheYiqiYangyinformula can regulate the disorder of liver glucose metabolism in type 2 diabetes model rats，the mechanism is to regulate both the insulin receptors and the enzymes related to glucose metabolism.

YiqiYangyinformula；Type2 diabetes；Liver；Glucose metabolism

國家自然科學基金(81373541)

100029北京中醫藥大學基礎醫學院方劑教研室

劉碧原(1990- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：方證相關及其生物學基礎的研究。E-mail：bucmyuan@foxmail.com

謝鳴(1956- )，博士，教授。研究方向：方證相關的研究。 E-mail：xieming603@263.net

R254.23

Adoi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.006

2016-04-09)