兔自體骨膜包裹肌腱移植前交叉韌帶重建實驗研究

崔巍 時劍輝 劉振中 王巖 曲穎 呂偉

兔自體骨膜包裹肌腱移植前交叉韌帶重建實驗研究

崔巍 時劍輝 劉振中 王巖 曲穎 呂偉

目的 觀察比較翻轉骨膜包裹自體肌腱移植、單純自體肌腱及骨膜正常包裹自體肌腱移植，重建前交叉韌帶移植物腱骨愈合的組織學變化過程。方法 取60只新西蘭白兔120膝，隨機平均分為翻轉骨膜組、正常骨膜組及肌腱組。切除兔雙膝前交叉韌帶，取其雙側拇長伸肌腱，及需要切取骨膜側脛骨上端內側骨膜，大小約1.5 cm×0.5 cm。同側肌腱折成2股重建兔雙膝前交叉韌帶。采用HE染色、甲苯胺藍染色，觀察重建術后3、4、8及12周時移植物腱骨愈合的變化情況。結果顯微鏡下觀察重建術后隨著時間推移，翻轉骨膜組較其他兩組腱骨界面可見成纖維細胞、纖維軟骨細胞更多表達；12周時，翻轉骨膜組腱骨界面間的膠原纖維數量及排列較其他兩組無明顯差異；生物力學測試術后3、4、8周骨膜翻轉組抗牽拉力明顯大于其他兩組，而術后12周組間對照無統計學差異。結論 骨膜包裹自體肌腱移植重建兔前交叉韌能夠在愈合期12周內促進腱骨結合部成纖維細胞、骨細胞及軟骨細胞的再生；對腱骨愈合具有積極的促進作用，超過愈合期則無差異。

兔；骨膜；前交叉韌帶；自體肌腱；移植

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關節中重要的穩定結構之一，具有重要的生理功能[1］。韌帶損傷如果通過MRI、X 線等[2］診斷后，應盡早行手術治療[3］。關節鏡下自體肌腱移植重建ACL已經成為主要治療方法之一。但重建術后移植物松動失敗也占有相當比例[4］。糾其原因有很多，其中腱骨愈合速度與程度是決定手術效果的重要因素[5-6］。本實驗的目的是觀察翻轉骨膜包裹自體肌腱移植重建ACL，移植物腱骨愈合的組織學變化過程，旨在為臨床應用此方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭白兔60只，5月齡，體重3.0 kg左右，由哈爾濱醫科大學動物實驗中學提供。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 分組 將60只白兔隨機分成：A骨膜翻轉縫合組（生發層面向骨道）；B骨膜正常縫合組（生發層面向肌腱）；C無骨膜包裹。

1.2.2 手術方法 應用20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，雙膝關節脫毛后消毒，于脛骨近端內側切取1.5 cm×0.5 cm骨膜備用，分別在同側足背切口，游離拇長伸肌并切取，A組以0#尼龍線進行股骨側，骨膜翻轉包裹后的2股肌腱編織縫合固定。以3.0鉆頭鉆通脛骨、股骨骨隧道，分別于骨道外口附近外固定一枚螺釘，以備栓樁。將制備好肌腱由引導線引入骨道內，并將兩側編織縫合線固定在螺釘處。打緊線結使移植物處于最佳位置。B組為股骨側骨膜不翻轉縫合；C組無骨膜包裹，其他手術方法同上。術后自由活動，常規應用抗生素，觀察創口。實驗過程中白兔膝關節無感染發生，無白兔死亡。于3、4、8、12周隨機處死15只（每組5只），隨機選取6只12膝（每組2只）進行顯微鏡下觀察，隨機選取9只18膝（每組3只）進行生物力學測試。

表1 各個組別不同時期生物力學測試及統計學檢驗結果[（±s），n=18］

表1 各個組別不同時期生物力學測試及統計學檢驗結果[（±s），n=18］

注：術后3、4、8周A組與B、C組間比較P＜0.05，術后12周組間比較P＞0.05

A B C P 3周（n=18） 51.27±1.36 29.68±2.21 27.44±2.68 0.000 5 4周（n=18） 69.22±6.54 52.81±3.83 50.77±5.59 0.000 1 8周（n=18） 104.27±4.84 80.66±4.62 78.33±6.12 0.000 1 12周（n=18） 126.35±5.44 120.63±4.45 118.83±5.64 0.06

1.3 觀測方法

1.3.1 顯微鏡觀察 給予標本固定，常規處理切片，HE染色后進行組織學觀察。

1.3.2 生物力學測試 三組實驗對象分別于3、4、8、12周時取材，拆除股骨側固定釘處的尼龍線，保留脛骨固定方式，切斷除重建的前交叉韌帶外的股骨和脛骨之間的軟組織，將標本固定在WDW-100微機控制電子萬能生物力學試驗機，加以5 mm/s的速度將肌腱從股骨隧道內拉出，并記錄腱骨分離時最大拉力載荷。

1.4 統計學處理

使用SPSS 17.0統計學軟件包進行數據檢驗，所有指標數據用（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 顯微鏡觀察

術后3周：A組：骨膜內有大量間充質細胞增生，并可見新生骨樣組織形成。腱骨結合部有大量細胞浸潤，主要為炎性細胞，其次為成纖維細胞，并出現少量纖維軟骨細胞，骨膜生發層部位還可見大量新生軟骨細胞，排列不規整。B組：骨膜增生，骨膜內可見部分新生軟骨細胞和基質，部分軟骨鈣化成骨。C組：腱骨界面通過大量膠原纖維連接，未見新生軟骨細胞及基質。

術后4周：A組：出現明顯的膜內化骨，在骨界面也可以看到膠原和結締組織為主要成分的新生骨質，并向肌腱內長入，新生骨小梁周圍可見大量骨母細胞呈柵形排列。B組：骨膜部位可見較多的軟骨細胞，腱骨接點處纖維結締組織增生，膠原排列尚紊亂，骨面見少量新生骨質。C組：腱骨界面間無新生骨形成，僅通過大量成纖維細胞及膠原纖維相連。

術后8周：A組：新生骨小梁與肌腱和骨隧道結合緊密，無間隙，排列比較規整，膠原纖維成束狀于鈣化組織交錯排列，沿力線方向有規律排列，趨于正常腱骨附著結構。B組：腱骨界面間可見新生骨骨島以及大量軟骨細胞，排列略規則，膠原纖維成束狀于鈣化組織交錯排列，沿力線方向較有規律排列。C組：腱骨界面間通過膠原纖維相連，排列紊亂，局部可見少量軟骨細胞及軟骨鈣化。

術后12周：A、B、C各組鏡下見新生骨小梁與肌骨隧道結合緊密，無間隙，排列規整，為正常腱骨附著結構。

2.2 生物力學測試結果

3、4、8周各組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），12周各組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。可見骨膜翻轉包裹肌腱在腱骨愈合的時間內無論是抗牽拉力還是腱骨結合強度都大于其他方式肌腱移植。

3 討論

3.1 腱骨結合處解剖學特點

腱骨之間的結合方式有兩種：（1）間接止點，由致密纖維結締組織構成，是動物模型中常見的愈合方式，特征為腱骨連接處由走向與骨道縱軸垂直的穿插性Sharpey纖維構成[7］。這些纖維是由Ⅲ型膠原組成，因其連接骨與肌腱，因此被看做是腱骨愈合的最早標志。（2）直接止點是由纖維結締組織、纖維軟骨、礦化的纖維軟骨及骨組織組成。是生理狀態下肌腱止點，也可見于愈合后腱骨連接部[8］。

3.2 影響腱骨愈合的因素

正常移植肌腱與骨愈合需經歷移植物的變性、血管再生、細胞再生、膠原沉著和基質重塑的過程。如果移植物與宿主具有較好的組織相容性并與骨道緊密接觸，就會很快地與骨道進行生長、結合，從而保證重建韌帶的早期穩定性。董向輝[9］等研究證實關節滑液對前交叉韌帶重建后韌帶的強度以及腱骨愈合有不利影響。而固定位點選擇不佳[10］、初期固定不牢固及過早、過度地進行康復訓練等都是影響腱骨愈合的重要因素。

3.3 自體骨膜促進腱骨愈合的機制

骨膜是由大量未分化祖細胞和基質顆粒組成內層（生發層）和大量成纖維細胞和膠原纖維束組成的纖維層（外層）構成；生發層含有豐富的未分化的間充質干細胞，這些細胞因外界的環境不可而分化成成骨細胞和軟骨細胞，目前已經有大量實驗證明骨膜能夠促進骨和軟骨的愈合。左百軍等[11］利用骨膜包裹自體跟腱重建兔ACL，發現能促進腱骨界面的炎性反應發生和細胞聚集以及成纖維細胞、骨細胞及軟骨細胞的再生，促進新生毛細血管的形成及軟骨分化，從而促進腱骨愈合。

本課題研究將骨膜翻轉后包裹肌腱縫合植入腱骨交接處，其生發層朝向不同的方向，在顯微鏡下可明顯觀察到同一時間節點軟骨成骨、新骨形成等有明顯差異，A組成骨特征明顯好于其他組別。這在腱骨愈合階段有著非常重要的臨床意義。而本研究的生物力學分析也可清的看到，翻轉骨膜包裹后的A組在術后3、4、8周抗牽拉抗拔出力均好于其他兩組。骨膜包裹后的肌腱移植可以明顯提高愈合速度和愈合強度，可以減少因制動而產生的關節僵硬，提前進行康復練習，降低關節粘連的發生幾率，提高患者滿意度，減少社會醫療資源的浪費。而在本研究中也可看到術后12周腱骨愈合后雖然在組織學形態上還有區別，但在生物力學測試中的到的數據并未提示有統計學差異。關節液中存在的多種影響腱骨愈合的物質，而骨膜包裹肌腱后可以最大限度封堵關節液進入腱骨界面間，減少關節液的不利影響，同時也減少骨隧道的擴大，促進腱骨愈合。

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Experimental Study on Anterior Cruciate Ligament Reconstruction with Autologous Periosteum Wrapped Tendon in Rabbits

CUI Wei SHI Jianhui LIU Zhenzhong WANG Yan QU Ying LV Wei Department of Orthopedics， Heilongjiang Hospital， Harbin Heilongjiang 150036， China

Objective To compare reverse periosteum w rapped autologous tendon transplantation， autologous tendon and normal periosteumw rapped with autologous tendon transplantation， reconstruction of anterior cruciate ligament graft tendon bone healing histological change. Methods 60 New Zealand white rabbits 120 knees were selected， the reversed periosteum group， the normal periosteum group and the tendon group. Resection of rabbit knee anterior cruciate ligament， the bilateral extensor pollicis longus tendon， and the need to cut the proximal tibia medial periosteal periosteum，the size of about 1.5 cm×0.5 cm. The same side of the tendon folded into 2 strands of anterior cruciate ligament reconstruction. Using HE staining，toluidine blue staining， observe the reconstruction after 3， 4， 8 and 12 weeks of shift plant tendon bone healing. Results Observation under the microscope after reconstruction with time reversal periosteum group than the other two groups of tendon bone interface fibroblasts， cartilage cells more expression， at 12 weeks， flip periosteum group tendon bone interface between the number and arrangement of the collagen fibers than the other two groups had no significant difference； biomechanical test after 3 and 4，8 week group of anti pulling force of periosteal turnover was significantly greater than the other two groups， and 12 weeks after operation there was no significant difference between groups. Conclusion Reconstruction of periosteumw rapped tendon autograft of rabbit anterior cruciate ligament can promote the regeneration of tendon bone healing in 12 weeks with fibroblasts， osteoblasts and chondrocytes； which plays a positive role in promoting the healing of tendon bone healing period， there were no differences over.

Rabbit， Periosteum， Anterior cruciate ligament， Autologous tendon， Transplantation

R 687

A

1674-9308（2016）26-0215-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.26.140

黑龍江省醫院骨科，黑龍江 哈爾濱 150036

呂偉，E-mail：cuiwei720409@sina.com