pH對嗜鹽混合菌發酵揮發性有機酸混合物合成PHA的影響

崔有為，張宏宇

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pH對嗜鹽混合菌發酵揮發性有機酸混合物合成PHA的影響

崔有為，張宏宇

（北京工業大學環境與能源工程學院，北京 100124）

嗜鹽混合菌發酵生產聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）具有免滅菌程序、產量高、易提取等優勢而被廣泛關注。集中考察了pH對嗜鹽混合菌（MMCs）發酵混合揮發性有機酸（VFA）生產PHA的影響。研究結果表明，在6.5～8.2范圍內pH對PHA合成沒有明顯影響，過高或者過低的pH都會降低PHA合成速率和VFA的吸收速率。發酵體系的pH影響了嗜鹽MMC的PHA產量，但是在酸性和堿性條件下卻存在不同的影響機制。堿性環境增大了VFA的解離程度，導致MMC對底物的吸收耗費大量的能量，造成VFA吸收速率的下降。這一作用在pH升高至9.2以上時表現顯著。酸性環境下，分子態VFA進入細胞后改變了胞內的pH，降低了相關酶和蛋白質的活性，從而影響了底物的利用。當pH5.2時微生物代謝及底物利用能耗量降低，導致PHA胞內降解利用率降低，刺激了PHA合成量的提高。PHA組分受pH影響不大，初始pH5.2～10.2時羥基脂肪酸戊酯（hydroxyvalerate，HV）所占比例維持在34.9%～38.3%范圍內。本研究對于進一步利用嗜鹽MMC發酵含有混合VFA的廢棄物生產PHA具有重要的指導意義。

聚羥基脂肪酸酯；pH；揮發性脂肪酸；嗜鹽混合菌

引 言

PHA具有良好的物理特性、生物相容性和生物可降解性，被認為是替代以石油為原材料化工合成塑料的重要物質，對緩解石油等化石燃料短缺、解決白色污染問題具有重要意義[1-3]。目前，以混合微生物（mixed microbial cultures，MMCs）替代純菌（pure cultures，PCs）生產PHA可以減少滅菌程序，可以使用廢棄底物為原料，被認為是降低PHA生產成本的有效方式[4-5]。目前以MMC合成PHA普遍使用兩步法：第1步篩選富集具有高PHA積累能力的菌群；第2步在限氮條件下進行PHA發酵生產。在兩步法工藝中，底物和工藝參數等都會對PHA的發酵生產造成影響。Beccari等[6]比較了不同碳源對發酵生產PHA能力影響，發現乙酸等VFA類底物最適合PHA的合成；在工藝運行層面，Moralejo-Garate等[7]發現DO對PHA合成量存在影響；Johnson等[8]發現溫度影響PHA的合成量；Wang等[9]發現底物中的營養成分，如C/N、C/P等條件也是影響PHA發酵合成量的重要參數。

在前期的研究中本文作者采集入海口底泥利用好氧動態給料（aerobic dynamic feeding，ADF）技術成功實現了嗜鹽MMCs的篩選和富集，并已證明其具有PHA合成能力[10-11]。在此基礎上，本研究將集中討論影響嗜鹽MMCs發酵生產PHA能力的運行因素。本文集中探討pH的可能影響。pH對微生物的可能影響主要體現在以下幾個方面：一是使細胞膜電荷發生變化，導致微生物細胞吸收營養物質能力改變；二是使生物大分子（蛋白質、核酸等）所帶電荷發生變化，從而影響其生物活性；三是使營養物質的可吸收性發生改變。因此，pH直接影響著微生物的生命活動、代謝方式和代謝產物[12]。發酵底物的pH可能對嗜鹽MMC合成PHA產生較大的影響。

MMC合成PHA的優勢體現在其可以利用廢水作為底物，相比較使用單一純底物生產PHA大大降低了生產成本[6-8]。由于VFA是PHA合成最有效的底物[6-7]，因此一些含有VFA的廢水成為MMC生產PHA的最重要目標。很多廢水，例如垃圾滲濾液、污泥厭氧消化液等含有大量的混合VFA。這為利用這些廢水生產PHA奠定了基礎。基于此，本研究以嗜鹽MMCs為研究對象，探索pH對嗜鹽MMC利用混合VFA發酵PHA的影響，從而探索嗜鹽MMC利用混合VFA廢水合成PHA的可行性。

1 實驗材料和方法

1.1 嗜鹽PHA積累混合菌的選擇和富集

實驗中所用的嗜鹽污泥采自河北省秦皇島市某河道入海口底泥。該地為人類活動較為頻繁地區。將采集的河底淤泥經過反復淘洗得到嗜鹽活性污泥[13-14]，接種該污泥到SBR反應器中進行PHA積累菌群的篩選。菌群選擇反應器為雙層玻璃夾心反應器，有效體積為2 L。反應器配有曝氣充氧設備和攪拌裝置。通過外接恒溫水浴裝置保證在反應器整個過程中溫度控制在（30±0.1）℃。反應器運行采用ADF模式，按照Johnson等[15]提出的篩選方法進行PHA菌群的選擇。具體篩選參數為：每天2個周期，每個周期12 h，包括進水5 min，好氧曝氣11.5 h，沉淀20 min，排水5 min。污泥齡（sludge retention time，SRT）控制在10 d。按照該方式連續運行200多個周期，在后50個周期內每個周期PHA積累最大量及其他參數穩定，并且已驗證該菌群具有良好的PHA積累能力[10]，完成了對MMCs的富集。

1.2 pH對嗜鹽MMCs發酵生產PHA影響實驗

采用富集的嗜鹽MMCs進行發酵生產PHA，考察發酵中pH對該菌群發酵生產PHA能力的影響。批次實驗中所用碳源為6種揮發性脂肪酸（VFA）的混合物。6種VFA的相對比例按照北京市某填埋場中滲濾液的VFA含量進行配制。依據前期的研究，該嗜鹽MMC實驗中MLVSS保持在（1800±100）mg·L-1。實際進水VFA含量如表1所示。最初pH的調節通過投加1 mol·L-1的HCl和1 mol·L-1的NaOH實現，實驗過程中不進行pH的調節。批次實驗的連續發酵時間均為24 h。每組實驗都設置一組平行實驗，兩次實驗的平均值作為最終結果。兩步法生產PHA的第2步要求嚴格限制氨氮的投加，從而抑制微生物的生長實現PHA在細胞內的最大積累。在發酵實驗中的發酵底物只含有VFA、營養元素和微量元素，不含氨氮。營養元素和微量元素濃度如下：26 mg·L-1KH2PO4，3.0 mg·L-1FeSO4·7H2O，1.2 mg·L-1MnSO4·H2O，1.5 mg·L-1ZnSO4·7H2O，7.6 mg·L-1KCl，8.0 mg·L-1CaCl2·2H2O，45 mg·L-1MgSO4。由于在發酵反應中氮素被限制而微生物無法增殖，因此在整個發酵過程中，微生物濃度和初始接種在發酵反應中的生物量一致[16]。

表1 批次實驗VFA含量

1.3 分析方法

氨氮、MLSS（mixed liquor suspended solids）和MLVSS（mixed liquor suspended solids）采用標準方法進行測定[17]。VFA含量的測定采用氣相色譜分析法（Agilent 7890A氣相色譜儀）[17]。PHA含量在樣本經過前處理后采用內標法進行氣相色譜分析。樣品前處理具體操作過程如下：從反應器中取40 ml泥水混合物，4000 r·min-1離心后棄去上清液，加入1 ml次氯酸鈉消毒液以使微生物失活，水洗兩遍后冷凍干燥。稱取凍干后的污泥樣品約25 mg于具塞消解管中，依次加入2 ml氯仿、2 ml苯甲酸鈉溶液，于105℃消解20 h，冷卻后加入1 ml去離子水，搖勻、離心，取下層有機相于盛有0.5 g左右無水硫酸鈉的2 ml塑料離心管中，搖勻。8000 r·min-1轉速下離心5 min，隨后取有機相進行氣相色譜分析。

1.4 表觀參數的計算

細胞內PHA濃度

初始細胞內的PHA含量

最大細胞內的PHA含量

碳源的PHA轉化率

最大底物比吸收速率

與西班牙語類似，貫穿全文的卡拉米洛披肩亦是受到外來文化的影響：“它是由印度婦女包裹孩子的布和西班牙披肩上打結的穗結合而成，中國宮廷的綢刺繡出口到馬尼拉，通過西班牙帆船進而到阿卡普爾科。殖民時期，由于禁止買西班牙人穿的那種衣服，墨西哥人開始用當地產的織布機織布，一種長長的窄窄的、潛移默化地收到外國影響的圍巾。（96）

最大PHA比合成速率

式中，P為PHA質量，mg；CDW為細胞干重（cell dry weight），mg；0為初始細胞內PHA質量分數，以占細胞干重的百分含量計，%；max為細胞內PHA最大質量分數，以占細胞干重的百分含量計，%；HB為PHA中羥基脂肪酸丁酯（hydroxybutyrate，HB）單體含量，以質量分數計，%；HB為HB單體分子量，mg·(mmol C)-1，以1.38 mg COD·(mg HB)-1計；HV為PHA中HV單體含量，以質量分數計，%；HV為HV單體分子量，mg·(mmol C)-1，以1.63 mg COD·(mg HV)-1計；PHA0為初始細胞內的PHA含量，mmol C·L-1；PHAmax為細胞內的PHA含量最大值，mmol C·L-1；0為初始底物濃度，mmol C·L-1；f為PHA含量最大時底物濃度，mmol C·L-1；a為反應器中生物量，mmol C·L-1。

2 實驗結果與討論

2.1 pH對PHA合成過程中VFA利用的影響

為了探究pH在PHA發酵生產過程中對VFA利用的影響，設置了6個pH下開展實驗。圖1(a)～(f)分別為pH4.2、5.2、6.5、8.2、9.2、10.2的初始pH下批次實驗中VFA的消耗情況。在馴化pH環境下（pH6.5）系統表現出快速的VFA利用速率。含量較低的正丁酸、正戊酸均在2 h內被完全利用，底物中的主要VFA物質乙酸和丙酸也在2 h內被快速利用并在4 h內耗盡，而與正丁酸、正戊酸含量相當的異丁酸、異戊酸在2 h內消耗量很小，在2 h后即其他VFA類底物基本耗盡時才開始快速利用，并在6 h時完全耗盡。不同種類VFA被微生物系統利用難易程度并不相同[18]。本文中研究支持這一結論，發現乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸的利用優先于異丁酸和異戊酸。當初始pH增至8.2時，6種VFA消耗情況與pH6.5條件下基本一致，說明初始pH在6.5～8.2的范圍內對微生物進行底物利用沒有明顯的影響。當初始pH提高到9.2時，濃度較低的正丁酸、正戊酸在2 h內耗盡，異丁酸、異戊酸在6 h時耗盡，這和pH為6.5和8.2時一致。然而，含量最高的兩種VFA類底物乙酸和丙酸消耗明顯緩慢，同時消耗用時推遲至6 h。當pH進一步提高至10.2時，該趨勢仍然存在，并且最難以利用的異丁酸、異戊酸消耗時間推遲至8 h。而當初始pH降至5.2時，在0～2 h內底物利用明顯受到抑制，VFA被利用的量很少。2 h后系統開始較為快速地利用底物，乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸在6 h時耗盡，異丁酸在8 h耗盡，異戊酸在10 h耗盡。當pH進一步降低至4.2時，水環境中VFA底物在24 h內沒有明顯變化，底物吸收速率十分微小，這表明pH達到4.2時超出了系統承受能力，微生物無法正常利用VFA。因此，pH在6.5～8.2范圍內對VFA底物的利用影響不大，提高或降低pH都會在一定程度上影響VFA的利用，并在pH降至4.2時底物利用被完全抑制。

圖1 不同初始pH下合成PHA批次實驗中6種VFA消耗情況

進一步從動力學角度對VFA總的消耗情況及底物中含量最高的乙酸、丙酸的消耗情況進行分析（表3）。當pH6.5時乙酸、丙酸和總VFA最大比吸收速率（分別為acetic acid、propionic acid、s）分別為0.45、0.16、0.73mmol C·(mmol C·h)-1，并且當pH提高至8.2時變化不大。而當pH提高至9.2時乙酸、丙酸和總VFA最大比吸收速率分別下降至0.27、0.12、0.53mmol C·(mmol C·h)-1。pH10.2情況下與pH9.2時基本相同。可以看出，當pH升高至9.2以上時丙酸的利用受到小幅度影響，而乙酸的利用受到嚴重的影響，同時乙酸利用速率的下降作為主要因素導致了VFA總量的利用速率下降。而當pH降低至5.2時，乙酸、丙酸和總VFA最大比吸收速率分別下降至0.29、0.12、0.48 mmol C·(mmol C·h)-1，與pH9.2時情況基本相同。當pH進一步降低至4.2時，幾乎沒有底物消耗。通過以上分析可知，嗜鹽MMCs的最優pH范圍是6.5～8.2。

2.2 pH對合成PHA組分的影響

文化調解并不意味著譯員需要對所有具有文化特性的因素進行解釋。實際上，只要有可能，口譯員都應該促使雙方進行直接交流。如果譯員的調解策略恰當，這是完全可以做到的。請看下面的例子。

如圖2所示為不同pH下嗜鹽MMCs的PHA合成最大量。pH6.5時，系統在4 h時干細胞內PHA最大積累量達到29.8%，此時HV所占PHA的比例（質量比）為38.3%。當初始pH為8.2時與pH6.5條件下PHA最大合成量、HV比例及PHA積累到達最大值所需時間基本一致。當初始pH提高至9.2時，PHA最大合成量下降至28.2%。同時HV比例也下降至36.2%，所需時間也推遲至6 h。該下降趨勢在pH提高至10.2時繼續延續，PHA最大合成量、HV比例分別下降至24.9%、34.9%。當pH降低至5.2時，盡管達到PHA合成量最大值所需時間延長至6 h，但PHA合成最大量升高至34.2%，HV所占比例為36.7%。當pH進一步降低至4.2時，PHA合成基本維持為初始含量。

圖2 不同初始pH下PHA合成最大量

表2 不同pH下PHA合成實驗中表觀動力學參數

2.3 pH對PHA合成影響的機理

表3 以pH6.5為基點比較不同pH下VFA消耗與PHA合成情況

Table 3 Comparison of VFA consumption and PHA production between different pH conditions and pH6.5

表3 以pH6.5為基點比較不同pH下VFA消耗與PHA合成情況

pH 4.200 5.20.6580.667 6.511 8.21.0140.972 9.20.7260.806 10.20.6990.611

Note:?,??are the fastest specific substrate uptake rate and the fastest specific PHA storage rate in condition of pH6.5, respectively.

在不同初始pH下進水中各種VFA的離子狀態濃度如表4所示，在pH4.2～9.2范圍內離子狀態的VFA量隨著pH的增加而增加，則對應的未解離的VFA量隨著pH的增加而減少。所以，在堿性條件下VFA大多呈離子狀態帶負電荷。而在微生物細胞外層同樣帶負電荷。根據同電相斥原理，離子狀態的VFA不能通過滲透作用進入細胞內，只能通過主動運輸等作用進入細胞內。Filipe[20]研究表明，未離解的VFA自由擴散進入微生物細胞不需要微生物呼吸供能。在較高的pH下離解的VFA進入細胞過程會明顯增加耗量。Kashket[21]建立的基本生物能學等式中，當細胞膜兩側的電勢差增加時底物進入細胞耗能也隨之增加。當胞外pHout過高時會使PMF有減小的趨勢。而微生物細胞在吸收VFA的過程中力圖維持PMF不變，所以微生物細胞勢將增大細胞膜兩側電勢差，從而導致吸收VFA過程需要的能量隨pH升高而增加。能耗的差異可能使pH升高不利于VFA底物的吸收利用。這可能是導致堿性條件下微生物利用底物受到抑制的主要原因。在酸性條件下VFA以未解離狀態存在，可以通過不耗能的方式滲透進入細胞。

表4 進水中不同初始pH下離子狀態VFA濃度

圖3 不同初始pH下PHA合成過程中系統pH的變化情況

3 結 論

本研究以富集的嗜鹽MMCs作為對象，集中研究了發酵體系的pH對發酵生產PHA的影響。嗜鹽MMCs的PHA合成在初始pH 6.5～8.2范圍內沒有明顯變化；當pH升高至9.2以上時底物利用速率會受到抑制，并由此導致PHA的合成量降低；酸性環境下，當pH5.2時微生物活性受到抑制，底物利用速率降低，但也降低了代謝及底物利用能耗量，導致PHA胞內降解利用下降，進而導致了PHA合成量升高。當PHA降低至4.2時微生物失去代謝能力不能進行PHA合成。PHA組分受pH影響不大，初始pH5.2～10.2時HV所占比例在34.9%～38.3%范圍內。目前關于嗜鹽MMCs的PHA合成研究很少，本研究從機理上對初始pH對嗜鹽MMCs的影響進行了分析，對于嗜鹽MMCs的進一步研究及工程化應用具有理論上的意義和指導作用。

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Influence of pH on PHA production by halophilic sludge fermenting mixed VFAs substrate

CUI Youwei, ZHANG Hongyu

(College of Environmental and Energy Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

Polyhydroxyalkanoates (PHA) production by halophilic mixed microbial cultures (MMCs) draw a lot of attention because of great advantages, such as free sterilization, easily extraction and high production. In this study, halophilic MMC was used to investigate the effect of pH on PHA production in the mixed VFAs fermentation process. The results indicated that there was no significant influence on PHA production in the pH range of 6.5—8.2. PHA production rate and substrate utilization rate would be inhibited in lower or higher pH conditions. PHA yield was influenced by pH in the systems, but different influencing mechanism existed in acidic condition and alkaline condition. Alkaline environment led to higher dissociation degree of VFAs. Then more energy needed as substrates being absorbed, which further led to the decrease of VFAs absorption rate. This affect was obvious when pH raised to 9.2. Molecular-state VFAs changed intracellular pH in the acidic condition. Then, the lower activity of related enzymes and protein resulted in slower substrate utilization. Energy consumption of substrate utilization and microbial metabolism reduced when pH5.2, resulting in the decrease of intracellular PHA degradation and the increase of PHA yield. The pH value had little influence on PHA component. And HV accounted for 34.9%—38.3% of PHA weight when the initial pH between 5.2 and 10.2. This study would be a guide for PHA production using mixed VFAs as carbon source by halophilic MMCs.

polyhydroxyalkanoate; pH; volatile fatty acid; halophilic mixed microbial cultures

2016-01-19.

CUI Youwei, cyw@bjut.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20160085

X 703

A

0438—1157（2016）10—4431—08

國家自然科學基金項目(51478011，51178004)；北京市自然科學基金項目(8132013)；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目。

2016-01-19收到初稿，2016-07-28收到修改稿。

聯系人及第一作者：崔有為（1977—），男，博士，教授。

supported by the National Natural Science Foundation of China (51478011, 51178004), theNatural Science Foundation of Beijing (8132013) and the Importation and Development of High-Caliber Talents Project of Beijing Municipal Institutions.