環介導等溫擴增（LAMP）技術及其在豬細菌病病原檢測中的應用

文/山東綠都生物科技有限公司　李天芝　于新友

山東省濱州畜牧獸醫研究院　沈志強

環介導等溫擴增（LAMP）技術及其在豬細菌病病原檢測中的應用

文/山東綠都生物科技有限公司李天芝于新友

山東省濱州畜牧獸醫研究院沈志強

環介導等溫擴增（LAMP）技術是一門新興的分子生物學檢測技術，因其具有特異性強、靈敏度高、快速、準確、操作簡便和成本低等特點，越來越受到獸醫相關工作者的關注。目前，該方法己被廣泛應用于各種豬病病原的檢測。文章綜述了LAMP技術在豬細菌病病原檢測中的應用研究進展，以期為今后豬細菌病的診斷和防控工作提供參考。

LAMP；豬細菌病；病原；檢測；應用

豬細菌病對當今養豬業造成巨大的威脅，目前養殖場主要是將病料送到專業檢測實驗室進行病原分離鑒定或PCR檢測，病原分離鑒定需要的時間相對較長，PCR檢測又需要特殊的儀器設備，不適合基層實驗室應用，一旦出現疫情，由于條件所限，很難實現對疫病的快速檢測。日本學者Notomi等［1］開發了一種新型核酸擴增技術，即環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術，該技術不需要模板的熱變性［2］、長時間溫度循環、繁瑣的電泳和紫外觀察等過程，整個反應在恒溫條件下進行，反應結束后，結果可用肉眼直接觀察［3］，在疫病診斷領域顯示了廣闊的應用前景。本文就LAMP技術及其在豬病病原檢測中的應用研究進展綜述如下。

1　LAMP技術

1.1LAMP擴增原理

LAMP技術是針對靶基因6個區域設計4條特殊引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右溫度下，啟動循環鏈置換反應，完成對目標DNA的大量擴增。在LAMP反應中，內引物雜交在目標DNA區，啟動互補鏈合成，導致啞鈴狀DNA產生。這種結構很快以自身為板，進行DNA合成延伸，形成莖-環DNA結構，然后以此結構作為LAMP循環的起始結構。由于內引物雜交在莖-環的環上，引物鏈置換合成的DNA產生一個有缺口的莖-環DNA中間媒介，在莖上附有目標序列。再通過外引物，在莖的末端形成環狀結構，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成具有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。

1.2LAMP引物設計

首先在靶基因的3'末端設定F3c、F2c、F1c 3個區段，在5'末端設定B1、B2、B3 3個區段。針對這6個區段設計4條引物，包括1對內部引物和1對外部引物。上游內部引物FIP：在3'末端含有與F2c互補的F2區段，在5'末端含有與F1c相同序列的區段下游內部引物BIP：在3'末端含有與B2c互補的B2區段，在5'末端含有與B1c相同序列的區段。上游外部引物F3：含有與目標DNA上的F3序列相同的區段。下游外部引物B3：含有與目標DNA的B3相同序列的區段，各引物組成及對應區域如下圖1所示。引物的設計要注意以下幾個問題：①擴增領域為F2～B2區段間，應該在200bp以內；②包含F2/B2在內的環狀部分的長度在40～60bp范圍內；③各區段的Tm值應該在60～65℃之間；④若只是為了鑒定靶基因存在與否，F1～B1的間距可以為0；⑤引物應避免二次結構發生；⑥各引物的3'端不可含有與其他引物互補的序列。

1.3LAMP技術特點

LAMP技術具有以下特點：①操作簡便、耗時短、成本低，擴增反應在等溫下持續進行，只需在恒溫水浴鍋中幾十分鐘即可完成，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性，適合在基層養殖場推廣應用；②擴增的效率高，沒有PCR反應中溫模板的退火、復性過程，在15～60min內可擴增109～1010倍，能滿足臨床病料樣本快速檢測的需要；③特異性高，由于是針對靶序列6個區域設計的4種特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高。針對6個區段使用4種不同的引物，可特異性擴增靶基因序列；④靈敏度高，檢測的敏感性是常規PCR的10倍，擴增模板可達10拷貝或更少；⑤僅使用一種鏈置換型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一種不耐熱的DNA聚合酶，因此必須在模板預變性以后再加樣；⑥擴增產物是在同一條DNA鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構；⑦當模板是RNA時，僅需加入逆轉錄酶即可與DNA一樣進行擴增。

圖1　LAMP的引物組成及對應區域

1.4反應產物的檢測

LAMP反應產物的檢測方法主要有5種：①以2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有典型的梯狀條帶泳判定結果；②以擴增產生的副產物焦磷酸鎂白色沉淀的產生用肉眼直接判斷擴增反應是否進行；③反應體系中加入溴化乙錠、SYBR Green Ⅰ等染料，通過觀察擴增結果是否產生相應顏色來判定是否有目的片段擴增；④通過恒溫擴增微流控芯片實時觀察反應結果；⑤運用實時濁度儀監測反應結果。

2　在豬細菌病檢測中的應用

2.1豬霍亂沙門氏菌檢測

豬霍亂沙門氏菌是引起豬沙門氏菌病的主要血清型，主要感染斷奶期仔豬，引發仔豬副傷寒，臨床上以急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等為特征，如果并發或繼發感染其他疾病或治療不及時，死亡率較高，給養豬業造成重大的經濟損失，嚴重困擾著養豬業的健康發展。時建立等［4］根據豬霍亂沙門氏菌lacZ基因設計特異性引物，通過優化各種反應條件，建立了檢測豬霍亂沙門氏菌的LAMP快速檢測方法，該法特異性好，靈敏度高，將細菌DNA稀釋到10-8仍可檢出，是PCR方法的1,000倍。

2.2豬鏈球菌血清2型檢測

豬鏈球菌2型（SS2）是一種重要的人獸共患病病原菌，它能引起豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，各年齡段豬均可感染豬鏈球菌病，但以3～12周齡豬，尤其斷奶仔豬最易感［5］，該病已成為嚴重影響各國養豬業發展的一種重要疫病［6］。張九州等［7］根據GenBank登錄的豬鏈球菌2型特異的莢膜多糖（cps2 H）基因序列作為檢測靶標，在其序列的保守區域設計LAMP引物，利用參考菌株S735基因組DNA為模板進行擴增，優化了LAMP的反應條件和反應體系，并進行了敏感性、特異性和重復性試驗。結果顯示，該法對SS2進行擴增，擴增產物顯色呈現陽性反應，電泳出現階梯狀條帶，最低檢測量為0.186fg/μL模板DNA，比常規PCR高1,000倍，且與其他常見的細菌無交叉反應。

2.3副豬嗜血桿菌檢測

副豬嗜血桿菌（Hps）可引起豬的副豬嗜血桿菌病，該病以纖維素性漿膜炎、多發性關節炎和腦膜炎為特征。近幾年來，世界各地均有發生副豬嗜血桿菌病的報道，并且發病率呈上升的趨勢，已經成為一個全球性的重要豬病［8］。隨著我國規模化養豬業的不斷發展，該病發作呈加速流行趨勢并成為多病原呼吸道疾病綜合征中的重要一員，危害日漸嚴重，對養豬業造成了巨大的經濟損失。車勇良等［9］建立了Hps可視化LAMP檢測方法，在55℃水浴1h即可對Hps核酸進行高效擴增，反應結束后加入SYBR Green Ⅰ即可通過肉眼觀察對結果進行判斷。該方法具有很強的特異性，其對DNA核酸的最低檢測限為40fg，是常規PCR檢測最低限的100倍，顯示出較高的敏感性。

2.4豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢測

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）作為豬傳染性胸膜肺炎的病原菌，可引起嚴重的傳染性呼吸道疾病，該病具有高發病率和致死率，廣泛分布于各國，主要感染生長育肥豬，可引起發燒、腹瀉以及嚴重的呼吸窘迫。劉亞娟等［10］根據APP ApxIVA基因的保守區設計6條-LAMP引物，建立了APP的LAMP方法。結果顯示，該法在64℃下反應15min，DNA即可出現擴增，擴增后2～3min內即可判定結果，最低檢測限為0.307ng/L，具有良好的重復性及穩定性，與其他病原菌無交叉反應，同時，試驗結果可實現肉眼可視化觀察。

2.5豬多殺性巴氏桿菌檢測

豬多殺性巴氏桿菌（Pm）為豬呼吸道綜合征的主要病原之一，可原發或繼發豬呼吸道綜合征，降低飼料利用率，嚴重影響養豬業的經濟效益。孫建華等［11］根據豬多殺性巴氏桿菌Plp B基因序列為靶基因設計特異性引物，建立了豬Pm特異性的LAMP快速檢測方法。經反應條件優化，確定反應條件為63℃、20min。檢測結果顯示，建立的LAMP檢測方法具有良好的特異性，靈敏度為25cfu/mL，與大腸桿菌、Hps、APP、沙門氏菌無任何交叉反應。

2.6金黃色葡萄球菌檢測

金黃色葡萄球菌感染可造成豬的急性、亞急性或慢性乳腺炎，壞死性葡萄球菌皮炎及乳房的膿皰病。蔡克周等［12］以金黃色葡萄球菌（CMCC10201）的femA基因作為靶序列，設計LAMP和PCR引物，通過凝膠電泳，判斷檢測結果。對8株常見致病菌進行LAMP特異性試驗，表明對金黃色葡萄球菌的檢測具有很高的特異性，LAMP檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度為8.7cfu/mL，直接檢測豬血中金黃色葡萄球菌的檢出限為8.7×102cfu/mL，PCR法的檢出限為8.7×103cfu/mL。

3　小結

LAMP技術作為一種快速基因擴增技術，自發明以來，在國內外疾病、衛生、食品及環境等多個領域都取得了重大成就，近年來受到了越來越多的關注，LAMP的整個過程均在恒溫條件下進行，不需要昂貴的儀器設備，而易在基層部門普及的檢測技術，避免了常規PCR對于溫度循環的特殊要求所帶來的各種不便，可快速、準確地做出傳染性疾病病原學診斷，從而及時有效控制疫情，使養殖場損失降到最低。但LAMP檢測技術同樣存在一些不足：①LAMP對于引物設計要求很高，需要設計的引物數目多、結構復雜。②檢測靈敏度太高，易因空氣中的氣溶膠污染而產生假陽性結果。③在LAMP擴增結果判定方面也存在一定的問題，當以瓊脂糖凝膠電泳法法判定結果時，結果為梯形條帶，不易鑒別非特異性擴增。當焦磷酸鎂白色沉淀和體系中添加染料法判定結果時，可能存在因結果顏色不明顯而造成肉眼觀察不便捷及誤判。另外，當有非特異擴增時，染料也可結合，影響結果判定。當微流控芯片和實時濁度儀法判定結果時，則需要購置昂貴的分析儀器，隨著研究的不斷深入，研究人員還將其原位雜交、免疫捕獲、核酸雜交等技術進行聯合，開發了很多有效的檢測方法，尤其是將環介導恒溫擴增與橫向流動試紙條技術結合，將環介導等溫擴增技術（LAMP）與橫向流動試紙條（LFD）聯合應用，建立一種新的病原快速檢測技術，即LAMP-LFD技術，使得LAMP現場檢測結果的觀察更加方便、直觀和準確。并解決了擴增產物形成氣溶膠污染環境，導致樣品間交叉污染的問題，開啟了基因檢測技術步入基層養殖場的應用新時代，極具推廣前景。目前已經有科研人員在CSFV的檢測方面［13］進行了一些探索，并取得了一定的成績，筆者認為，LAMP-LFD技術將是未來LAMP檢測技術將來的發展方向，在一些基層實驗室和流行病學調查等領域具有廣闊的應用前景。■

［1］ Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop- mediated isothermal amplifi cation of DNA［J］. Nucleic Acids Research， 2000，28（12）：63.

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［5］ Reams RY， Glickman LT， Harrington DD， et al. Streptococcus suis infection in swine： a retrospective study of 256 cases.PartⅡ.Clinical signs， gross and microscopic lesions， and coexisting microorganisms［J］. J Vet Diagn Invest， 1994，6（3）：326～334.

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［10］ 劉亞娟，聶福平，楊俊，等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP方法的建立［J］.中國獸醫學報，2016（2）：200～205.

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［12］ 蔡克周，薛崇浪，張旻，等.環介導等溫擴增檢測豬血中金黃色葡萄球菌［J］.肉類研究，2012，26（11）：27～30.

［13］ 朱俊靈，葉佐東，鄧潔汝，等.豬瘟病毒RT-LAMP-LFD檢測方法的建立與應用［J］.華南農業大學學報，2016，37（1）：1～7.

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-06-011-14）；

山東省自然科學基金（ZR2012CQ012）；山東省技術創新項目（201220916006）。