發酵食品乳酸菌分離鑒定及功能特性研究

任大勇，榮鳳君，宮圣潔，朱劍威，張振業，劉宏妍，于寒松

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.吉林農業大學中藥材學院，吉林長春130118）

發酵食品乳酸菌分離鑒定及功能特性研究

任大勇1，榮鳳君1，宮圣潔1，朱劍威1，張振業1，劉宏妍2，于寒松1

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.吉林農業大學中藥材學院，吉林長春130118）

對發酵食品中分離出的7株乳酸菌進行了亞硝酸鈉、乳糖、膽固醇降解試驗、抗氧化活性試驗和抑菌試驗，篩選出益生功能較強的乳酸菌菌株。結果表明：菌株A1對亞硝酸鈉和膽固醇的降解率都是最高，分別為91.8%和56.6%，對乳糖降解率最高的是A2，降解率為73.9%，菌株A2對亞硝酸鈉的降解率也超過90%。3種抗氧化試驗的結果各不相同，自由基清除率最高的是A4，為94.6%；羥基清除率最高的是A7，為40.9%；亞鐵離子清除率最高的是A1，為71.1%。經過100℃處理后的乳酸菌抑菌效果沒有發生太大的改變；經酶處理后，加入胃蛋白酶和胰蛋白酶的A6菌液對大腸桿菌，沒有產生抑菌效果。

乳酸菌；亞硝酸鈉；膽固醇；乳糖；抑菌試驗

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能在可發酵碳水化合物中產大量乳酸的一類細菌的統稱。這類益生菌在很多領域中有著很高的應用價值，例如它們可以用于發酵乳制品、發酵蔬菜、酸面包、青貯材料、微生物飼料添加劑等［1］，乳酸菌細胞染色多呈革蘭氏陽性，有球狀和桿狀兩種菌體形態，不形成內生孢子，無運動性［2］。大量研究表明，乳酸菌能促進營養成分的吸收、分解；能夠保持微生態平衡，調節機體胃腸道正常菌群，抑菌抗病，健胃整腸，提高食物生物價和消化率，維持和改善機體正常機能；增強免疫功能；降低血清膽固醇；具有抗癌功能；乳酸菌還可提高食品的儲藏性能，延長其儲藏期［3-5］。

本試驗對發酵食品中乳酸菌進行研究，對乳酸菌的抑菌作用、耐膽鹽和降解亞硝酸鈉、降膽固醇等特點并發揮其潛在的功能，尋找到品質優良而且高效能耐膽鹽、降解亞硝酸鈉、降膽固醇等的乳酸菌菌種應用食品加工方面，更好的利用到我們的生產、生活當中具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料

農家腌制的酸菜和辣白菜：置于無菌袋內，經4℃儲藏、密封、運輸到實驗室。

1.1.2菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus.Frankland）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）菌株：由吉林農業大學食品科學與工程學院毒理學試驗室分離并保存。

1.1.3試劑

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐溫-80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15 g加蒸餾水1 000 mL，調節pH（6.2±0.2）（加瓊脂為液體培養基）。

MRS-乳糖培養基：將MRS培養基中的葡萄糖替換成為乳糖濃度為4.6%，與牛奶相當。

MRS-膽固醇培養基：MRS培養基中添加0.2%巰基乙酸鈉、0.3%牛膽鹽，并加入膽固醇使體系中膽固醇濃度為100 μL/mL。

LB培養基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸出物5.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1 000 mL。

PBS緩沖液：磷酸二氫鉀0.27 g、硫酸二氫鈉1.42 g、氯化鈉8 g、氯化鉀0.2 g加入800 mL蒸餾水充分攪拌，然后加入濃鹽酸調制需要的pH，最后定容到1 000 mL。

鹽酸萘乙二胺、硫酸鋅、對氨基苯磺酸、濃鹽酸、亞硝酸鈉、乙醇、氫氧化鉀、正己烷、鄰苯二甲醛-冰醋酸、濃硫酸、蒽酮硫酸、Tris-Hcl緩沖液、鄰苯三酚、O-菲啰啉、硫酸亞鐵、雙氧水、抗壞血酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、氯化鈉、蒸餾水。

1.1.4儀器

離心機：上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫培養箱：湖北省黃石市醫療器械廠；電子天平：上海佑科儀器表有限公司；Delta320 pH計：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；電熱恒溫水浴鍋：上海新苗醫療器械制造有限公司；KYC-100B空氣恒溫搖床、凈化工作臺：上海新苗醫療器械制造有限公司；漏斗，濾紙，玻璃棒，培養皿，試管，試管架，移液槍，三角錐瓶，鑷子，牛津杯。

1.2方法

1.2.1分離

1.2.1.1樣品處理

從樣品中各取1 g，分別加入到10 mL滅菌后的離心管內，并加入9 mL的蒸餾水進行稀釋，將樣品按照10倍梯度稀釋。

1.2.1.2分離純化

取100 μL稀釋的樣品，加入含1.6%溴甲酚綠酒精液MRS固體培養基上并涂勻，37℃恒溫48 h后，培養基上如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養基變為黃色者初步定為乳酸菌，挑取明顯菌株用MRS液體培養基活化，進行菌株編號，37℃培養12 h后，取少量活化好的培養液，用革蘭氏染色并做鏡檢，篩選出符合乳酸菌形態特征的菌株，鏡檢之后將其保存在MRS培養基中，從酸菜中篩選出的菌株命名為A1、A2、A3，從辣白菜中篩選出的菌株命名為A4、A5、A6、A7。

1.2.2降解亞硝酸鈉

取1 mL濃度為0.25 mg/mL無菌亞硝酸鈉溶液加入9 mL MRS肉湯培養基，在37℃厭氧條件下培養48 h，同時做空白試驗。溫育結束，取5 mL培養液，加入10 mL硫酸鋅（0.42 mol/L）溶液，靜置后過濾，以沉淀蛋白與脂肪。濾液稀釋50倍，在5 mL稀釋液中加入0.4%的對氨基苯磺酸（0.4 g對氨基苯磺酸溶于20 mL濃鹽酸，并用蒸餾水定容至100 mL容量瓶）2 mL，靜置5 min后加0.2%的鹽酸萘乙二胺1 mL，充分混勻，避光顯色5min后，在538 nm處測定混合溶液的OD值［6］。同時進行標準曲線的制作（亞硝酸鈉含量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）。

式中：P1為接種乳酸菌0 h培養液中亞硝酸鈉的OD值；P2為接種乳酸菌48 h后培養液中亞硝酸鈉的OD值。

1.2.3同化膽固醇

將乳酸菌液按照1%的體積比加入MRS-膽固醇培養基，37℃厭氧溫育24 h，并做空白試驗。溫育后，取1 mL菌液于EP管，12 000 r/min 4℃離心5 min，收集0.5 mL上清液，加入3 mL 95%的乙醇和2 mL 50%的KOH，振蕩1 min混勻，60℃水浴10 min，使皂化完全。然后，加入5 mL正己烷混勻，靜置15 min分層，取有機溶劑相（上相），加入3 mL蒸餾水振蕩后靜置15 min，使兩相完全分離。取上相2.5 mL，80℃水浴蒸干正己烷，加入4mL鄰苯二甲醛-冰醋酸溶液（0.5mg/mL）振蕩1 min，靜置10 min。最后，取2 mL濃硫酸終止反應，室溫靜置10 min，在550 nm處測其吸光值［7］。同時進行標準曲線的繪制（膽固醇濃度范圍為0、10、20、30、40、50 μg/mL）。

同化率/%＝（1-P2/P1）×100

式中：P1為接種乳酸菌0 h培養液中膽固醇含量的OD值；P2為接種乳酸菌24 h后培養液中膽固醇含量的OD值。

1.2.4乳糖不耐癥

向5 mL MRS-乳糖液體培養基中加入乳酸菌液200 μL，37℃溫育24 h，并做空白試驗。在培養液中添加0.42 mol/L的硫酸鋅溶液10 mL，靜置30 min，過濾。將濾液稀50倍后，在1 mL稀釋液中加入4 mL 0.2%蒽酮硫酸溶液，混勻后，沸水水浴10min，冷卻至室溫，在620 nm處測其吸光值［8-9］。同時繪制乳糖的標準曲線（濃度為0～0.1 mg/mL）。

式中：P1為接種乳酸菌0 h培養液中乳糖含量的OD值；P2為接種乳酸菌24 h后培養液中乳糖含量的OD值。

1.2.5體外抗氧化性

1.2.5.1清除超氧自由基

將0.1 mL樣品加入2.8 mL Tris-HCl緩沖液（pH= 7.2）后，加入60 mmol/L的鄰苯三酚0.1 mL，37℃水浴反應5 min，加入2滴8 mol/L的HCl終止反應，于325 nm處測其OD值［10］。

式中：P1為試驗組吸光度的OD值；Ps為對照組吸光度的OD值；P0為調零組吸光度的OD值。

鄰苯三酚加樣表如表1所示。

表1　鄰苯三酚加樣表Table 1Sample list of phosphorus benzene three phenol

1.2.5.2清除羥基自由基

在試管中加入2.5 mmol/L的O-菲啰啉、pH=7.4的PBS緩沖液、蒸餾水各1 mL，充分混勻后加入1 mL 2.5 mmol/L的硫酸亞鐵和1 mL 0.1%的H2O2，37℃溫育1 h，在536 nm處測其吸光度為P1；用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2的吸光值為P0；用1 mL樣品代替1 mL蒸餾水的OD值為P2。

式中：P1為加入雙氧水的對照組的吸光值；P0為加入蒸餾水的調零組的吸光值；P2為加入樣品的試驗組的吸光值。

1.2.5.3螯合亞鐵離子

0.1mL樣品中加入0.1 mL 1%的抗壞血酸，0.1 mL 0.4%的FeSO4和1 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液，混合均勻，于37℃水浴20 min后，三氯乙酸沉淀蛋白，4 000 r/min離心10 min，取0.2 mL上清液加入2 mL 0.1%的O-菲啰啉，反應10 min后在510 nm處測其OD值，同時做空白試驗（加PBS）。

式中：P0為加PBS的體系的OD值；P1為加樣品的體系的OD值。

1.2.6抑菌試驗

本試驗以本大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌為致病菌，進行抑菌試驗。

1）取活化好的乳酸菌培養液進行12 000 r/min離心，4℃離心10 min，取上清液及上清液在100℃下保持15 min的液體，進行抑菌試驗；

2）取12 000 r/min離心10 min的乳酸菌上清液，在上清液中分別加入過氧化氫酶（0.5 mg/mL）、胰蛋白酶（1 mg/mL）、胃蛋白酶（1 mg/mL），37℃水浴1 h，用于抑菌試驗；

3）用鑷子夾取牛津杯放到LB固體培養基上，吸取100 μL處理后的乳酸菌菌液滴加于牛津杯中，每個平板貼3個～4個牛津杯。同時，用0.15 mg/mL的頭孢噻呋鈉作為參比。平板于37℃恒溫培養箱培養12 h后，觀察有無抑菌圈，及其直徑大小，比較抑菌圈大小［11］。

2結果與討論

2.1分離菌株的測序結果

乳酸菌16SrDNA序列鑒定結果見表2。

表2　乳酸菌16SrDNA序列鑒定結果Table 2Identification results of 16SrDNA sequence of lactic acid bacteria

由表2可知，對7株菌株進行菌屬鑒定，結果顯示A1、A2、A3、A5菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），A4菌株為唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius），A6菌株為德氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii），A7菌株為短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis）。

2.2乳酸菌對亞硝酸鈉、膽鹽、乳糖降解率的影響

乳酸菌對亞硝酸鈉、膽鹽、乳糖的影響見表3。

表3　乳酸菌對亞硝酸鈉、膽鹽、乳糖的影響（n=3）Table 3Effects of lactic acid bacteria on sodium nitrite，bile salt，lactose（n=3）

從表3中可以看出，對亞硝酸鈉的降解率在86.2%～91.8%之間，降解率最好的是A1，為91.8%，降解率最低的是A7，為86.2%；對膽固醇的降解率在22.8%～56.6%之間，降解率最好的是A1，為56.6%，降解率最低的是A7，為22.8%；乳糖的降解率在58.3%～73.9%之間，降解率最高的是A2，為73.9%，降解率最低的是A1，為58.3%。

2.3體外抗氧化

體外抗氧化結果比較見表4。

表4　體外抗氧化結果比較（n=3）Table 4Comparison of antioxidant activity in vitro（n=3）

從表4中可以看出，自由基清除率在80.7%～94.6%之間。清除率最高的是A4，為94.6%，清除率最低的是A2，為80.2%；羥基的清除率在6.8%～40.9%之間，清除率最好的A7，為40.9%，清除率最低的是A2，為6.8%；螯合亞鐵離子的清除率在25.5%～71.1%之間，清除率最好的是A1，為71.1%，清除率最低的是A7，為25.5%。

2.4抑菌試驗

乳酸菌上清液的抑菌效果如表5所示。

表5　乳酸菌上清液的抑菌效果（cm，n=3）Table 5The inhibitory effect of lactic acid bacteria supernatants（cm，n=3）

通過表5可以得出對大腸桿菌抑菌性好的菌株是A1、A6，直徑分別是2.8 cm和2.6 cm；對蠟樣芽孢桿菌抑菌性較好的菌株分別是A1、A6，抑菌圈的大小差不多，分別為2.4 cm和2.3 cm；對金黃色葡萄球菌抑菌性較好的菌株是A1、A3，抑菌圈直徑分別為2.1、2.0 cm；對沙門氏菌的抑菌效果較好的菌株為A2、A4，抑菌圈的直徑為2.0、2.1 cm。

通過抑菌試驗結果，篩選出對每1株致病菌抑菌性強的兩株乳酸菌進行耐熱試驗和酶試驗，并進行結果分析，結果如表6所示。

從表6可以看出，經100℃處理后，5株乳酸菌的抑菌效果沒有發生變化，還保留其抑菌活性，說明產生的抑菌物質中含有耐熱物質。

表6　熱處理對乳酸菌活性的影響（cm，n=3）Table 6Effect of heat treatment on the activity of lactic acid bacteria（cm，n=3）

不同酶對乳酸菌抑菌活性的影響如表7所示。

表7　不同酶對乳酸菌抑菌活性的影響（cm，n=3）Table 7Effects of different enzymes on the antibacterial activity of lactic acid bacteria（cm，n=3）

從表7中可以看出，加入胃蛋白酶、過氧化氫酶和胰蛋白酶的A1、A2、A3、A4的菌液對致病菌的影響不大，但是加入了胃蛋白酶和胰蛋白酶A6的菌液對大腸桿菌沒有抑菌效果。

3結論

3.1乳酸菌對亞硝酸鈉、膽固醇和乳糖降解率的比較

相同乳酸菌能產生不同的益生功能，導是其益生能力的不同。本試驗采用3種不同的方法對乳酸菌益生能力進行測試，結果顯示相同菌株的益生功能各不相同，原因可能是由于不同乳酸菌產生的活性物質不同；相同菌株對亞硝酸鈉、膽固醇和乳糖降解能力的不同，導致益生功能的不同［12-14］。在試驗的的7株乳酸菌中，A1植物乳桿菌對亞硝酸鈉的降解率最高，為91.8%，對膽固醇降解率最高的也是A1植物乳桿菌，降解率為56.6%，可能是因為其益生成分相同，導致降解率的相同；對乳糖降解率最高的是A2植物乳桿菌，降解率為73.9%，對亞硝酸鈉的降解率也超過90%。A1、A2兩株乳酸菌可應用到功能性食品中進一步研究、開發和應用。

3.23種抗氧化方法的比較

不同菌株乳酸菌的抗氧化能力不同，同一株乳酸菌通過3種不同方法對其進行抗氧化能力測試，結果顯示方法不同抗氧化能力也不相同。原因可能是由于不同乳酸菌起抗氧化作用的活性物質的不同；相同的菌株對清除羥自由基、超氧陰離子自由基及亞鐵離子清楚率的能力不同，導致其抗氧化的機制有所不同［15］。在試驗的7株乳酸菌中，A4唾液乳桿菌對超氧自由基清除率最高，清除率為94.6%；對羥基清除率最高的則是A7短乳桿菌，清除率為40.9%；而對亞鐵離子清除率最高的則是A1植物乳桿菌，清除率為71.1%。可能是因為抗氧化成分、抗氧化機制和抗氧化條件的不同，導致其抗氧化能力的不同。

3.3抑菌試驗

有大量研究證實乳酸菌對致病菌（蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）具有抑制作用，其代謝物抑菌性得到廣泛應用，不同的菌株對致病菌的抑菌效果存在很大的差別［16-18］。從表5、表6、表7中可以看出，7株乳酸菌的上清液對致病菌都有不同程度明顯的抑菌效果，通過致病菌對選出的菌株又進行了熱處理和加酶試驗，可知道篩選出的菌株的上清液含有耐熱物質，加熱后對抑菌效果沒有太大影響；經過酶處理后，只有加入胰蛋白酶和胃蛋白酶A6德氏乳桿菌的菌液對大腸桿菌沒有抑菌效果，其他經過酶處理的菌株的抑菌效果不受影響。初步推測乳酸菌產生抑菌物質是有機酸；而A6德氏乳桿菌菌株加酶后，卻對大腸桿菌沒有抑菌效果，可能是代謝物里含有蛋白或小肽，經酶處理后將其分解，對致病菌沒有抑菌效果。

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Isolation，Identification and Functional Properties of Lactobacillus Derived from Fermented Foods

REN Da-yong1，RONG Feng-jun1，GONG Sheng-jie1，ZHU Jian-wei1，ZHANG Zhen-ye1，LIU Hong-yan2，YU Han-song1
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.College of Chinese Herbal Medicine，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China）

In this experiment，7 strains of lactic acid bacteria isolated from fermented foods were carry out lactose，sodium nitrite，cholesterol degradation，antioxidant activity and antibacterial experiment，screening of lactic acid bacteria probiotic function.The results showed：the degradation of sodium nitrite and cholesterol was the highest rate of strain A1，respectively，91.8%and 56.6%.The lactose degradation rate of A2 was the highest，the degradation rate was 73.9%，the strain A2 degradation rate of sodium nitrite was also more than 90%，threekinds of antioxidant experimental result were not the same，free radical scavenging rate of A4 was the highest，94.6%；hydroxyl radical of A7 was the highest rate was 40.9%，ferrous ion the clearance rate of A1 was the highest，71.1%，lacticacidbacteriaantibacterialeffectafter100℃treatmentwerenotmuchchanged；Aftertheenzymetreatment，A6bacteriumwasaddedtopepsinandtrypsinonEscherichiacoli，hadnoantibacterialeffect.

Lactobacillus；sodiumnitrite；cholesterol；lactose；antibacterialexperiment

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.044

2015-11-25

吉林省教育廳項目［吉教科合字（2015）第196號］

任大勇（1979—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品微生物。