不同雜交家系鐵皮石斛花多糖、浸出物及氨基酸質量分數分析

呂素華，徐　萌，張新鳳，劉京晶，斯金平

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

不同雜交家系鐵皮石斛花多糖、浸出物及氨基酸質量分數分析

呂素華，徐萌，張新鳳，劉京晶，斯金平

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

鐵皮石斛Dendrobium officinale花是鐵皮石斛藥材的非藥用部位，為測定其多糖、浸出物、氨基酸的質量分數，探討3種成分之間的內在關系，全面了解鐵皮石斛花中的物質分布規律，利用藥典方法測定鐵皮石斛花的多糖、浸出物質量分數，并采用17種氨基酸標準品，通過酸水解法提取、異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生處理樣品，結合反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定10個不同雜交家系鐵皮石斛花中的氨基酸組成與質量分數。結果表明：鐵皮石斛花中多糖質量分數平均為71.00 mg·g-1，浸出物質量分數為300.00 mg·g-1；從鐵皮石斛花中檢測到16種氨基酸，總氨基酸平均質量分數為7.88%；3種成分質量分數差異顯著（P＜0.05）。利用SPSS 17.0分析3種成分之間的相關性，多糖和浸出物在合成積累上呈現負相關，與氨基酸之間相關性不明顯（P＞0.05）。鐵皮石斛花中含有較豐富的多糖、浸出物及氨基酸等營養及功效成分，具有一定的保健開發價值。圖1表3參11

中草藥學；鐵皮石斛花；氨基酸；多糖；浸出物；相關性

鐵皮石斛Dendrobium officinale主要以莖入藥，其質量主要以多糖、浸出物含量作為評價依據［1］。鐵皮石斛花雖是非藥用部位，但在栽培生產中產量較大，民間多用來制作花茶，已有報道其含有黃酮類［2］、多糖［3］、氨基酸［4］等成分。本課題組在鐵皮石斛雜交選育中發現：不同來源的鐵皮石斛親本雜交出來的子代鮮花在外觀、氣味、顏色等方面表現差異較大，但關于鐵皮石斛雜交家系鮮花在多糖、醇溶性成分、氨基酸等成分上的分布規律及質量分數還未見報道。本試驗采集不同雜交家系鐵皮石斛鮮花，參照藥典方法測定多糖及浸出物質量分數，并以17種氨基酸為標準，采用異硫氰酸苯酯（PITC）進行柱前衍生［5-6］，結合反相高效液相色譜法（RP-HPLC）［7］分析鐵皮石斛花中氨基酸質量分數，探討多糖、浸出物和氨基酸等成分之間的相關性，比較樣本之間的品質差異，揭示鐵皮石斛花中主要營養及功效成分的分布及比例，對鐵皮石斛花的品質研究及資源開發利用具有重要的理論意義。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

AB104-N電子分析天平（中國梅特勒托利多儀器上海有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（中國上海森信實驗儀器有限公司）；D-37520型高速離心機（德國 Heraeus公司）；GENESYS 10S UV-Vis紫外分光光度儀；DHG-9070HA精密性強制對流干燥箱（中國杭州藍天化驗儀器廠）； Agilent 1200高效液相色譜系統（美國Agilent公司，含四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器）。

安捷倫氨基酸分析柱，17種氨基酸混合標準溶液：天冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu），絲氨酸（Ser），甘氨酸（Gly），組氨酸（His），精氨酸（Arg），蘇氨酸（Thr），丙氨酸（Ala），脯氨酸（Pro），酪氨酸（Tyr），纈氨酸（Val），蛋氨酸（Met），胱氨酸（Cys），異亮氨酸（Ile），亮氨酸（Leu），苯丙氨酸（Phe），賴氨酸（Lys），購自中國天津博納艾杰爾公司。

葡萄糖標準品（購自中國藥品生物制品鑒定所，110833-200904）；重蒸酚（中國北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為分析醇，水為自制蒸餾水。

1.2供試樣品

供試樣品10個雜交家系鐵皮石斛親本來自于中國主要分布區內［8-9］，所有雜交子代鮮花均于2014 年5月12號采自浙江省義烏丹溪藥博園，雜交家系有1×6，80×27，6A×2B，78×69，9×66，森山1號，83×34，80×56，17×30，68×72。采集的鐵皮石斛花樣品均于65℃烘箱中烘干，粉碎，過60目篩，干燥器中保存備用。

1.3方法

1.3.1多糖質量分數測定方法參照《中華人民共和國藥典：2010年版一部》，精密稱量不同家系鐵皮石斛花粉末各0.30 g，加入200.00 mL蒸餾水2.00 h回流提取，過濾定容至250.00 mL。移液管精密量取5.00 mL于50.00 mL離心管中，加25.00 mL無水乙醇，4℃冰箱靜置1.00 h后，4 000 r·min-1離心20.00 min，棄上清液加入體積分數為80.00%乙醇20.00 mL離心20.00 min，重復2次，棄上清液，沉淀加水助溶，定容至50.00 mL。加1.00 mL樣品溶液于試管中，冰水中加體積分數5.00%苯酚1.00 mL，混勻后加入5.00 mL濃硫酸，充分混勻，冰水中靜置5.00 min，沸水浴20.00 min，取出在冰水中放涼，于488.00 nm處測定吸光度，試驗平行3次。以葡萄糖標品制作標準曲線，回歸方程為y=8.717 1x+ 0.014 7，R2=0.999，其中y為吸收度，x為質量濃度。

1.3.2浸出物質量分數測定方法參照《中華人民共和國藥典：2010年版一部》附錄ⅤA項下熱浸法測定，以體積分數為95.00%無水乙醇做溶劑。精密稱定供試樣品2.00 g，置于100.00 mL具塞圓底燒瓶中，精密加乙醇50.00 mL，密塞稱定質量靜置1.00 h，85℃水浴回流微沸1.00 h，放冷取下密塞并補足差質量，搖勻過濾，移液管精密量取25.00 mL，置于干燥至恒量的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃烘箱干燥3.00 h，干燥器冷卻30.00 min，迅速精密稱定質量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的質量（%），試驗平行3次。

1.3.3氨基酸質量分數測定方法①標準溶液及試劑配制。標準溶液：氨基酸混合標準溶液除胱氨酸濃度為1.25 mmol·L-1，其余16種氨基酸濃度均為2.50 mmol·L-1，置于冰箱中備用，使用前室溫放置30.00 min。異硫氰酸苯酯乙腈溶液：準確移取25.00 μL一流氰酸苯酯溶液與2.00 mL乙腈混勻。三乙胺乙腈溶液：準確移取1.40 mL三乙胺，乙腈定容至10.00 mL容量瓶中。正亮氨酸內標溶液：精確稱取正亮氨酸10.00 mg，加0.10 mol·L-1鹽酸溶液10.00 mL溶解，混勻。流動相A（乙酸鈉緩沖鹽溶液）：精密稱取15.20 g無水乙酸鈉，去離子水1 850.00 mL，溶解后冰醋酸調pH 6.50，然后加乙腈140.00 mL，混勻，0.45 μm濾膜過濾，超聲30.00 min備用；流動相B：體積分數為80.00%乙腈水溶液。②色譜條件。Venusil AA氨基酸分析柱（4.60 mm×250 mm，5.00 μm），流動相：A，B柱溫40.00℃，進樣量10.00 μL，波長254 nm，流速1.00 mL·min-1。流動相梯度（B）：0～2.00 min，0.00%～0.00%；2.00～15.00 min，0.00%～10.00%；15.00～25.00 min，10.00%～30.00%；25.00～33.00 min，30.00%～45.00%；33.00～33.10 min，45.00%～100.00%；33.10～38.00 min，100.00%～100.00%；38.00～38.10 min，100.00%～0.00%；38.10～45.00 min，0.00%～0.00%。③樣品水解液制備。參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》。精密稱取鐵皮石斛花樣品各0.20 g，精確到0.000 1 g，置于20.00 mL水解管中，加10.00 mL含體積分數為0.10%苯酚的6.00 mol·L-1鹽酸，振搖使樣品均勻分散于溶液中，-20.00℃冰箱冷凍3.00～5.00 min，N2封管。（105.00±1.00）℃烘箱中水解24.00 h，取出冷卻至室溫。水解液1.00 mL，濃縮至干后加1.00 mL濃度為0.10 mol·L-1鹽酸助溶，0.45 μm微孔濾膜過濾后儲于冰箱，衍生備用。④鐵皮石斛花水解液HPLC柱前衍生。1.50 mL離心管中分別準確吸取氨基酸標準溶液及樣品200.00 μL，加入正亮氨酸內標溶液20.00 μL，三乙胺乙腈溶液100.00 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100.00 μL，混勻，室溫靜置1.00 h。加入正己烷400.00 μL，振搖后放置10.00 min，取下層溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，待測。樣品溶液中各種氨基酸質量濃度（mg·L-1）=f1/f2×c。其中：f1為樣品溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積；f2為混合氨基酸標準溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積。c為氨基酸對照品質量濃度（mg·L-1）。⑤氨基酸數據分析。利用方差分析比較不同家系鐵皮石斛花各氨基酸含量的差異，使用SIMCA-P統計軟件（Version 11.0，Umea，瑞典）進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）。該分析方法可提供變量重要性投影參數（VIP）定量估計每個單元的區分能力，VIP值可根據自己區分不同類別的能力對描述對象進行分類［10］。以不同氨基酸含量為變量進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），分析不同家系之間氨基酸含量的差異。

2　結果與分析

2.1鐵皮石斛花多糖、浸出物質量分數

利用苯酚-硫酸法和熱浸法分別對不同品系鐵皮石斛花中多糖和浸出物質量分數進行測定，結果如表1所示。《中華人民共和國藥典：2010年版一部》中規定鐵皮石斛莖多糖質量分數不得低于250.00 mg· g-1，醇溶性浸出物不得低于65.00 g·kg-1（6.50%）。本試驗測定鐵皮石斛花中多糖約為71.00 mg·g-1，比莖中要低；花中浸出物平均約為300.00 mg·g-1，遠遠高于藥典標準，說明其含有豐富的次生代謝物質。由表1可以看出：不同家系間鐵皮石斛花多糖、浸出物差異顯著，其中68×72，6A×2B，78×69和森山1號4個家系鐵皮石斛花多糖質量分數顯著高于其他家系，1×6，80×27，9×66和83×34浸出物質量分數顯著高于其他家系。

表1　不同雜交家系鐵皮石斛花中多糖及浸出物質量分數Table 1　Polysaccharide and extracts contents of 10 Dendrobium officinale hybrids flowers

2.2鐵皮石斛花氨基酸質量分數

通過酸水解、柱前衍生HPLC對鐵皮石斛花中的氨基酸進行分析，得鐵皮石斛花液相色譜圖（圖1）。通過氨基酸指紋圖譜對比發現，10個家系花的氨基酸組成基本一致。與標品相比，除了胱氨酸外共檢測到了16種氨基酸。鐵皮石斛花中含有包括蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸等在內的7種必需氨基酸，另外9種基本氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。

圖1　氨基酸標樣和鐵皮石斛花樣品色譜圖Figure 1　HPLC chromatography of 17 amino acids standard and Dendrobium officinale flowers

由表2可知：鐵皮石斛花中總氨基酸平均質量分數為78.52 mg·g-1，其中必需氨基酸平均為30.25 mg·g-1，基本氨基酸平均為48.26 mg·g-1。在所有分析的家系中，83×34的總氨基酸質量分數最高，達到98.02 mg·g-1；1×6，78×69，80×56，68×72等4個家系的總氨基酸質量分數均大于80.00 mg·g-1。1×6，9×66，78×66等3個家系中必需氨基酸占總氨基酸的比例顯著高于其他家系（P＜0.05）；83× 34，68×72中基本氨基酸占總氨基酸的比例顯著高于其他家系（P＜0.05）。

在10個鐵皮石斛家系花檢測到的7種必需氨基酸平均質量分數為2.57～8.81 mg·g-1，7種必需氨基酸差異顯著（P＜0.05），其中異亮氨酸和亮氨酸是鐵皮石斛花中的主要必需氨基酸，顯著高于其他5種氨基酸（P＜0.05），平均質量分數分別為8.81 mg· g-1和6.42 mg·g-1，約占必需氨基酸總質量分數的50.00%以上；蛋氨酸平均質量分數最少，僅有1.28 mg·g-1，僅占必需氨基酸的4.24%。

9種基本氨基酸在1.82～12.64 mg·g-1范圍內。9種基本氨基酸質量分數差異顯著（P＜0.05），其中天冬氨酸顯著高于其他8種（P＜0.05），平均為12.64 mg·g-1，占基本氨基酸質量分數的26.02%；其次是谷氨酸（9.94 mg·g-1），占20.47%；組氨酸在基本氨基酸中最低（1.82 mg·g-1），僅占基本氨基酸質量分數的3.75%。

通過表2中不同氨基酸方差分析可知：不同家系氨基酸質量分數差異顯著（P＜0.05），且天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和脯氨酸對不同家系氨基酸組成貢獻值最大。

2.3鐵皮石斛花多糖、浸出物、氨基酸相關性分析

對鐵皮石斛花的多糖、浸出物和氨基酸進行相關性分析，結果見表3。鐵皮石斛花中多糖和浸出物之間存在極顯著負相關，說明在鐵皮石斛花中多糖與浸出物的積累中，隨著其中一類成分的增加，另一類成分就會呈下降的趨勢。在植物開花期間，多糖作為營養成分會有消耗，因而表現出浸出物的積累增長。多糖、浸出物與氨基酸之間相關性不明顯，說明多糖、浸出物的質量分數對氨基酸的營養積累影響較小。此外，必需氨基酸和基本氨基酸、總氨基酸存在極顯著正相關，基本氨基酸和總氨基酸之間存在極顯著正相關，浸出物與基本氨基酸、必需氨基酸、總氨基酸相關性不明顯。

3　討論

通過對10個鐵皮石斛花樣本的分析發現，鐵皮石斛花中多糖達71.00 mg·g-1，浸出物約為300.00 mg·g-1，多糖質量分數明顯低于莖條。不同家系鐵皮石斛花多糖、浸出物質量分數差異顯著（P＜0.05），說明不同家系親本來源不同會影響鐵皮石斛花多糖、浸出物的合成積累。鐵皮石斛花的浸出物質量分數明顯高于莖條，周桂芬等［2］曾報道鐵皮石斛花中含有豐富的黃酮類化合物，說明黃酮類物質是浸出物的主要組成類型之一。

表2　不同雜交家系鐵皮石斛花的氨基酸質量分數Table 2　Amino acids contents of 10 hybrids Dendrobium officinale flowers

本試驗采集了10個鐵皮石斛家系的樣品，樣本量豐富，并且采用17種標準氨基酸、柱前衍生HPLC分析的手段進行氨基酸分析，較全面反映鐵皮石斛花中氨基酸的分布及質量分數范圍。鐵皮石斛花中含有豐富的氨基酸，總氨基酸大約是花干質量的7.88%。從鐵皮石斛花酸水解樣品中共測得16種氨基酸，其中包括7種人體必需氨基酸和9種人體基本氨基酸，分別占花干質量的3.00%和4.80%。其中異亮氨酸、亮氨酸在必需氨基酸中所占比例較高，而在基本氨基酸中天冬氨酸分布較多。龔慶芳等［4］報道，鐵皮石斛花中主要氨基酸為精氨酸、脯氨酸，但在本試驗所有檢測樣本中精氨酸與脯氨酸分別是總氨基酸的5.79%和4.54%，而天冬氨酸是總氨基酸的16.10%，與鐵皮石斛莖條中的氨基酸分布及質量分數大致相當［11］。另外，在所有樣品中未能檢測到胱氨酸，同樣在鐵皮石斛莖中也未檢測到胱氨酸［11］，說明胱氨酸在鐵皮石斛各部位中積累較少。在10個鐵皮石斛家系花樣品中，各氨基酸質量分數存在著顯著差異（P＜0.05），說明親本的遺傳因素會影響營養成分的積累。

表3　鐵皮石斛花中多糖、浸出物與氨基酸的相關性Table 3　Correlation among polysaccharide，extracts，amino acids

鐵皮石斛花中多糖與浸出物在合成積累上呈現負相關，多糖、浸出物與氨基酸的營養積累未表現出明顯的相關性，必需氨基酸與基本氨基酸呈顯著正相關，質量分數差異明顯（P＜0.05）。本試驗選取10個家系樣本進行多糖、浸出物及氨基酸的分析，證實了鐵皮石斛花中含有較多的營養及功效成分，與鐵皮石斛莖有相似的成分組成，研究結果可作為鐵皮石斛花的品質評價的參考。此外，鐵皮石斛花在成分分布及質量分數上有獨特之處，有必要對它們進行深入研究，發掘其保健功效，對鐵皮石斛花的開發利用具有深遠的意義。

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Polysaccharides，extracts，and amino acids in hybrid Dendrobium officinale flowers

Lü Suhua，XU Meng，ZHANG Xinfeng，LIU Jingjing，SI Jinping
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

Dendrobium officinale flowers，which have many non-medicinal folk applications，were studied to determine the distribution and correlation of substances.Using pharmacopeia methods 1）the polysaccharide content，2）the extracts，and 3）the amino acid content were determined by acid hydrolysis and phenyl iso-thiocyanate（PITC）pre-column derivatization combined with a Reversed-phase-high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）assay.SPSS 17.0 was used for the analysis.Results showed D.officinale flowers had an average of 71.00 mg·g-1polysaccharides and 300 mg·g-1extracts；16 kinds of amino acids having 7.9%of total amino acids were found.The SPSS 17.0 analysis for the relationship of the three ingredients revealed a negative correlation for the synthetic accumulation between polysaccharide and extracts，but no significant correlation with amino acids.In all，D.officinale flowers had nutritional and functional components including polysaccharides，extracts，and amino acids offering potential health benefits.［Ch，1 fig.3 tab.11 ref.］

Chinese herbology；Dendrobium officinale flowers；amino acids；polysaccharide；extracts；correlation

S567.9

A

2095-0756（2016）05-0749-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.004

2015-09-17；

2015-10-27

浙江省科學技術公益技術應用項目（2015C32097）

呂素華，從事藥用植物遺傳改良研究。E-mail：1037420126@qq.com。通信作者：張新鳳，副教授，博士，從事天然產物及藥用植物質量評價。E-mail：zhangxf73@163.com

浙 江 農 林 大 學 學 報，2016，33（5）：749-755

Journal of Zhejiang A＆F University