貼梗海棠花粉生活力的測定

朱金儒，孫曉光，張曉曼

（1.保定市交通運輸局，河北保定　071000；2.河北農業大學，河北保定　071000）

貼梗海棠花粉生活力的測定

朱金儒1，孫曉光1，張曉曼2

（1.保定市交通運輸局，河北保定071000；2.河北農業大學，河北保定071000）

以貼梗海棠初開花朵為試驗材料，研究了TTC、碘原碘化鉀2種染色劑測定花粉生活力的效果，離體培養時葡萄糖對花粉萌發的影響和3種不同溫度（15、20、25益）條件下的花粉萌發的變化規律，3種貯藏條件（常溫、4益、-23益）對花粉貯藏的影響。結果表明：不同染色劑測定的花粉生活力差異顯著，TTC染色法（76.26%）顯著優于碘原碘化鉀染色法（42.46%）。在一定范圍內，培養基葡萄糖濃度和萌發溫度提高能促進花粉的萌發，超出范圍后抑制萌發。試驗證明：最佳的葡萄糖濃度為10%，最佳的萌發溫度為20益。貯藏溫度對花粉生活力的影響顯著，其中最佳的貯藏條件是冷凍干燥，但綜合考慮成本、便捷性等因素，實際應用中一般選擇4益。

貼梗海棠；花粉萌發；生活力測定；貯藏條件

貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）又名貼角海棠、貼梗木瓜、皺皮木瓜，薔薇科木瓜屬，落葉灌木，高達20m[1]。貼梗海棠早春葉前開花，鮮艷美麗，簇生枝間，且有重瓣及半重瓣品種，秋天又有黃色、芳香的碩果，是一種很好的觀花、觀果灌木。宜于庭院、草坪、花壇內孤植或叢植，又可以作為綠籬及基礎種植材料，同時也具有極高的藥用價值。以往對貼梗海棠的研究多數集中在組織培養、中藥化學成分、植株繁殖栽培、品種分類等方面，對于花粉相關研究有鄭林等[2]對花粉形態的描述，董美芳等[3]對花粉超低溫保存1周后萌發率與不同的解凍方式的關系研究，但其試驗中的應用條件是水培條件，并且花粉來自盛開的花朵，而花粉生活力受開花程度的影響顯著。為此，本研究通過染色法、培養基萌發法，對不同貯藏條件下貼梗海棠花粉生活力的影響進行了測定，以期為貼梗海棠的生產、科研提供數據參考。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗采用的貼梗海棠，種植于河北農業大學西校區，試驗當天上午10：00采收花蕾數朵，將其快速地帶回實驗室，并取出其花藥，混合均勻后分別裝入3個干燥的花粉瓶中，用塞子塞住瓶口，放入20益的光照培養箱中暫時儲存以備使用，用時隨機取出1份。

1.2方法

1.2.1形態觀察法

直接在光學顯微鏡下觀察花粉形狀、對稱性、極面觀和赤道面觀特點、萌發器官類型、外壁紋飾特點等。在觀察的過程中，隨機選擇花粉20粒，測量赤道軸長、極軸長、條紋寬度、穿孔大小、穿孔密度、萌發溝長等。

1.2.2TTC染色法

取少量花粉于載玻片上，加1滴蒸餾水，再加入1滴0.4%TTC溶液（取0.04gTTC溶解在10mL磷酸鹽溶液中，置入4益冰箱中），在25益的光照培養箱中培養15min后置于顯微鏡下觀察。凡被染成紅色的花粉均為有生活力的貼梗海棠花粉。

1.2.3碘原碘化鉀染色法

根據淀粉遇碘變藍的原理，從藍色的深淺程度來判斷貼梗海棠花粉粒中淀粉的含量，進而確定貼梗海棠花粉粒活性的高低。稱取1.3g碘化鉀溶解于10mL的蒸餾水中，再加入0.3g的碘，等到全部溶解后加蒸餾水定容到100mL容量瓶中，配制成碘-碘化鉀溶液。用頭發絲刮取少許貼梗海棠花粉散落到載玻片上，加入1滴蒸餾水使花粉全部散開，再滴入1滴碘-碘化鉀溶液立刻置顯微鏡下觀察。被染成藍色的均為有生活力的花粉，呈黃褐色的則是不具有生活力的花粉[4]。

1.2.4不同葡萄糖濃度對花粉萌發的影響

在硼酸溶液濃度均為20mg/L的基礎上，稱取1g瓊脂，加入少量的硼酸溶液，加蒸餾水至100mL，裝入燒杯，加熱攪拌使瓊脂充分溶解呈透明狀即溶液沸騰（注意補充水分，以保持培養基的濃度），加入葡萄糖，配制葡萄糖濃度分別為0（清水對照）、5%、10%、15%、20%、25%共6個不同濃度的培養基。取6個干凈的載玻片，用滴管吸取少量的培養基，趁熱分別滴在載玻片的凹槽內，放置片刻，使培養基凝固。用棉簽蘸取少量的貼梗海棠花粉輕輕均勻地撒播在培養基表面，注意切不可過多，否則難以觀察，將制備好的載玻片放在墊有濕潤濾紙的培養皿內，于25益的光照培養箱中培養；待貼梗海棠花粉萌發后于顯微鏡下觀察并統計發芽率。觀察時每片隨機取3個視野，統計貼梗海棠花粉總數及發芽數，計算平均萌發率（花粉觀察總數不少于100粒）。萌發率=（萌發花粉粒數/花粉粒總數）伊100%。在培養基上進行貼梗海棠花粉的人工萌發，鑒定貼梗海棠花粉萌發率的高低[4]。

1.2.5不同溫度對花粉生活力的影響

將貼梗海棠花粉接種于僅有瓊脂的空白培養基上，分別在15、20、25益下培養4h后統計花粉萌發率，確定最佳培養溫度。

1.2.6不同貯藏條件對貼梗海棠花粉生活力的影響

為了找到貼梗海棠花粉最佳的貯藏條件，采用了TTC染色法研究了不同的貯藏溫度和貯藏時間對貼梗海棠花粉生活力的影響。將剛采集的貼梗海棠花粉裝入干燥潔凈的青霉素小瓶中，并加入硅膠粒干燥劑，采用常溫干燥貯藏、常溫貯藏、4益冷藏干燥貯藏、4益冷藏貯藏、-23益冷凍干燥貯藏、-23益冷凍貯藏6種方法，采用TTC染色法測定花粉生活力，起初每24h測定1次，1周后每5d測定1次，直到花粉完全失去生活力，方法及操作如1.2.2[4]。

2　結果與分析

2.1形態觀察法

形態觀察法是根據不同植物典型性，如花粉粒的大小、形態、色澤等來判斷貼梗海棠花粉的生活力。結果顯示：貼梗海棠花粉為長球形，赤道面觀橢圓形，花粉大小（46.06～46.47）滋m伊（22.83～23.34）滋m，花粉為單粒、等極、輻射對稱，極面觀三裂圓形，外壁為皺波狀紋飾，紋飾不清晰，穿孔少[5]。雖然這種方法簡單易行，但不同的采集時間和保存時間對花粉的大小、色澤、形態、生活力等都會產生很大的影響。因此，此方法較適合于貼梗海棠新鮮花粉生活力的檢測。

2.2TTC染色法與碘-碘化鉀染色法測定貼梗海棠花粉生活力的研究

觀察發現，貼梗海棠花粉均為長球型。用TTC染色法測定貼梗海棠花粉的生活力，花粉細胞出現紅色（76.26%）、淡紅色（19.15%）無色（4.59%）3種顏色反應，并且隨著時間的延長，細胞的染色率逐漸下降（表1）。

而用碘-碘化鉀染色后，染成深藍色（即有生活力）的花粉有42.46%，黃褐色（即沒有生活力）的花粉為57.54%，花粉生活力低于50%（表2）。結果表明：碘一碘化鉀染色法不能準確地測定貼梗海棠海棠花粉生活力。這是因為多數植物正常的成熟花粉粒積累有較多的淀粉，碘原碘化鉀溶液可將其染成藍色，而貼梗海棠可能是由于積累較少淀粉的緣故，所以碘原碘化鉀溶液不能準確地測定貼梗海棠花粉生活力。分析認為，具有活性的花粉細胞產生的NAD2H2可將無色的TTC還原成紅色的TTF而使本身被染成紅色，次活力的被染成淡紅的，而無生活力的貼梗海棠花粉因為沒有呼吸作用或呼吸作用很弱，變化不明顯[6]。兩種測定方法比較，TTC染色法更適合用于貼梗海棠花粉生活力的測定。

表1　溫度對密度和全干干縮率的影響

表2　碘原碘化鉀染色法中花粉細胞染色變化情況

2.3培養基中不同葡萄糖濃度對花粉生活力的影響

由圖1可知，不同濃度的葡萄糖對貼梗海棠花粉的萌發率和萌發速度均有影響。在不添加葡萄糖的培養基中，貼梗海棠花粉仍然有萌發現象，但是萌發率很低，花粉萌發率僅為3.54%耀8.75%，培養基中加入葡萄糖時花粉萌發率顯著提高，隨著葡萄糖濃度的增加，花粉萌發率呈現先上升后下降的趨勢，當葡萄糖濃度為10%時，花粉萌發率達到最高，接種培養2、4、6、8h后，花粉萌發率分別為10.30%、14.02%、12.37%、8.45%，見圖1。當葡萄糖濃度超過10%時，花粉萌發率隨著葡萄糖濃度的增大而下降，試驗結果表明：貼梗海棠花粉萌發最適宜的葡萄糖濃度為10%。

圖1　培養基中葡萄糖濃度對花粉生活力的影響

花粉在培養基上培養，隨著觀察時間的推移，花粉的萌發率呈現先升高后下降的趨勢，過早觀察，花粉還未開始生長；過晚觀察，花粉的生活力下降。試驗結果表明：觀察花粉萌發的最佳時間是4h后。8h后觀察，花粉的生活力明顯下降到最低。說明隨著時間的延長，花粉生活力逐漸下降。

2.4不同溫度對花粉生活力的影響

試驗結果顯示：在15益時花粉的萌發率為8.62%，20益時升高至9.15%，25益時又下降至8.75%。可知在15耀25益培養條件下，隨著溫度的升高，花粉萌發率呈現先升高后降低的趨勢，貼梗海棠花粉萌發的最佳培養溫度為20益。

2.5不同貯藏條件對貼梗海棠花粉生活力的影響

花粉生活力的強弱受遺傳因素和外界環境的因素影響，貯藏時間是影響花粉生活力的一個主要因素，但是由于貯藏溫度不同，貼梗海棠花粉生活力下降速度也相對不同。從圖2可以看出：貼梗海棠花粉生活力受到貯藏溫度、貯藏時間的影響較大，干燥處理對花粉生活力的影響較小。常溫保存的貼梗海棠花粉7d后萌發率迅速下降到0，說明花粉在溫室條件下，生活力下降速度極快，可能是因溫度過高，從而增加了花粉內部的呼吸強度，從而導致花粉內部營養枯竭。在低溫條件下貯藏的花粉呼吸作用受到抑制，花粉生活力下降速度相對較慢。在4益干燥條件下，貼梗海棠花粉生活力逐漸下降，貯藏到第30天，花粉的萌發率降到0%。而在-23益冷凍干燥條件下，貼梗海棠花粉生活力下降緩慢，在貯藏30d時，花粉萌發率降到38.57%，貯藏到50d時，花粉萌發率為18.74%。與室溫貯藏相比，4益和-23益冷凍處理花粉的萌發率下降速度較慢，能夠明顯延長貯藏時間，但以-23益處理較好。然而，對于雜交育種來說，遠程雜交的花粉，保存時無需在冷凍條件下進行，一般采用冷藏處理即可保存花粉，并且對設備的需求低，盡可能在采集花粉3d內完成。

圖2　不同貯藏條件下貼梗海棠花粉生活力隨時間的變化趨勢

3　結論與討論

（1）利用染色法對花粉生活力測定具有快速簡便的優點，但是受到花粉自身性質（例如花粉細胞壁的厚薄、花粉外壁的組成物質、花粉內各種酶活性的強弱等）的影響較大，因此不同的染色法只適合某些植物花粉生活力的測定。試驗證明：碘原碘化鉀溶液不能準確地測定貼梗海棠花粉的生活力，可能是由于貼梗海棠花粉體內積累較少淀粉的緣故。而TTC染色法可以很快測定花粉的活力，并且具有時間短、操作簡便等的優點。

染色法對貼梗海棠花粉萌發的影響，一般情況下，染色法測定結果大都高于培養基萌發法測定結果。但染色法和培養基萌發法測定的結果不能相互比較，兩者之間存在差異，差異一方面說明花粉在染色法測定條件下可能比在柱頭上自然條件下萌發的能力高；另一方面說明發芽法測定結果可能比實際情況偏低。在最適宜的濃度條件下，不同植物花粉的萌發力不同。不同植物的花粉生活力保持時間的長短也不一樣，一方面是受環境因素的影響，另一方面也由遺傳因素所決定。雖然花粉萌發率不能完全等同于花粉生活力，但在實踐中大多數是以花粉萌發率來表示花粉生活力的[7-8]。

（2）培養基中葡萄糖濃度影響貼梗海棠花粉的萌發率，葡萄糖對貼梗海棠花粉的萌發、生長發育有著重要的影響，葡萄糖可以維持花粉與培養基成分之間的滲透壓平衡，為花粉的萌發和花粉管的伸長提供營養物質。葡萄糖濃度過高過低都不適合貼梗海棠花粉的萌發。濃度過低，則貼梗海棠花粉壁破裂而內含物散出；濃度過高，則貼梗海棠花粉細胞發生質壁分離，從而抑制花粉萌發伸長。試驗結果表明，當葡萄糖濃度為10%時，貼梗海棠花粉萌發率最高。

（3）測定不同貯藏條件對貼梗海棠花粉生活力的影響。結果證明：低溫貯藏優于常溫貯藏處理；干燥貯藏法優于非干燥貯藏法；在6種花粉的貯藏方法中，以低溫干燥貯藏法最好。證明了低溫干燥貯藏法比較有利于保持貼梗海棠花粉的生活力，采用此方法貯藏的花粉在貯藏20d后仍然有生活力。

［1］陳有民.園林樹木學［M］.北京：中國林業出版社，2011：516-517.

［2］鄭琳，陳紅，張雷，等.木瓜屬植物的花粉形態及品種分類［J］.林業科學，2008，44（5）：53-57.

［3］董美芳，陳明海，賈婉，等.不同培養條件和貯藏方法對皺皮木瓜花粉萌發率的影響［J］.河南大學學報（自然科學版）2012，42（3）：291-294.

［4］趙興華，張道旭，印東生，等.百合花粉生活力測定和貯藏方法研究［J］.北方園藝，2009（2）：172-175.

［5］鄭琳，陳紅，張雷，等.木瓜屬植物的花粉形態及品種分類［J］.林業科學，2008，44（5）：53-57.

［6］劉會超，賈文慶，杜曉華，等.金銀花花粉生活力測定及貯藏研究［J］.安徽農業科學，2010，38（11）：5854-5856.

［7］尤揚，賈文慶，等.西府海棠花粉生活力測定［J］安徽農業科學，2011，39（6）：3423-3425.

［8］于洋.百合遠緣雜交不親和性及其克服方法的研究［D］.哈爾濱：東北農業大學碩士論文，2008.

Studies on Measurement Methods of Pollen Viability

ZHU Jin-ru，SUN Xiao-guang1，ZHANG Xiao-man2
（1.Baoding City Transprotation Bureau，Baoding，Hebei 071000；
2.Agricultural University of Hebei Province，Baoding，Hebei 071000）

The birth of quince flowers as experimental material,studied the TTC，iodine,potassium iodide determination of two kinds of stain pollen viability,the effect of glucose on pollen germination in vitro culture and the influence of three dif原ferent temperature）15益。20益，25益）under the condition of the rule of variation of pollen germination,three kinds of storage conditions（temperature，4益，-23益）affect pollen storage.The results showed that:significant difference was found in determina原tion of different stain of pollen viability,TTC staining（76.26%）were significantly better than iodine-potassium iodide staining（42.46%）.Within a certain range,glucose and temperature can promote the germination of pollen，beyond the scope of in原hibiting germination,the experiment proved that the best glucose concentration was 10%,the best germination temperature is 20益.Storage temperature has significant influence on pollen viability,one of the best storage conditions is 4益.

Chaenomeles speciosa；Pollen Germination；Pollen viability；Storage

Q944.58

A

1002-3356（2016）03-0010-04

2016-05-22

河北省林業廳科學技術研究項目（1402450），河北省教育廳重點項目（ZD2016132）

朱金儒（1966-），男，工程師。E-mail：958890646@qq.com。

張曉曼（1977-），女，副教授。E-mail：173610925@qq.com。