小麥β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆與酵母表達

夏凌峰，史 雪，楊昊虹，李春蓮，王中華，權 力

(西北農林科技大學農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

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小麥β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆與酵母表達

夏凌峰，史 雪，楊昊虹，李春蓮，王中華，權 力

(西北農林科技大學農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

超長鏈脂肪酸是生物體內眾多重要物質的合成底物。KCS基因編碼β-酮脂酰CoA合成酶，該酶具有底物特異性，參與超長鏈脂肪酸延伸的縮合反應，是超長鏈脂肪酸合成的限速步驟。為了探究小麥KCS基因在超長鏈脂肪酸合成中的功能，采用同源克隆的方法從小麥(TriticumaestivumL.) 中克隆出KCS基因后，利用生物信息學對其編碼序列進行分析，并在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中對其進行真核表達。結果表明，小麥 TaKCS6基因的開放閱讀框為1 287 bp，編碼428個氨基酸殘基。結構域預測結果顯示，TaKCS6蛋白含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和C末端3-酰基ACP合酶III結構域，屬于KCSs蛋白家族。序列比對分析結果顯示，TaKCS6氨基酸序列與擬南芥及其他植物的KCS6氨基酸序列在兩個功能結構域上和活性位點保守。酵母表達結果顯示， TaKCS6基因編碼的蛋白參與C24以上超長鏈脂肪酸的延伸。

普通小麥；超長鏈脂肪酸；KCS基因；酵母表達

超長鏈脂肪酸(Very-long-chain fatty acids, VLCFAs)是指烴鏈長度超過18個碳原子的脂肪酸[1-3]，其在生物體內具有多種生理功能，主要存在形式為：三酰甘油、甘油磷脂、鞘磷脂和蠟質[4]。在植物體中，超長鏈脂肪酸主要以三酰甘油的形式作為儲藏能源存在于種子中[1, 5-6]。甘油磷脂和鞘磷脂是生物膜結構的主要成分，并且作為信號分子參與生物體內的生命活動[7]。此外，超長鏈脂肪酸是構成植物表皮蠟質的前體物質[2]，蠟質可以保護植物免受包括干旱、冷害、空氣污染、紫外光照射、病菌侵染等多種逆境脅迫的傷害[8]。

超長鏈脂肪酸的生物合成分為兩個階段，首先在質體中經過從頭合成的16碳與18碳脂肪酸被轉運到內質網上的脂肪酸延伸酶復合體(Fatty acid elongase complex)，然后16碳與18碳脂肪酸經過縮合、還原、脫水和再還原4個步驟后，形成增加了2個碳原子的超長鏈脂肪酸[2, 9]。其中，縮合反應為限速步驟，參與該反應的β-酮脂酰CoA合成酶由KCS基因編碼，具有底物特異性，決定了超長鏈脂肪酸的碳鏈長度[1, 10-11]。擬南芥KCS家族有21個基因，其中 AtFAE1/AtKCS18是第1個從擬南芥中克隆出來的KCS基因[10]，突變體表現出種子中超長鏈脂肪酸含量大大降低[12]。 AtKCS1與 AtFAE1/AtKCS18序列相似性很高，參與蠟質的生物合成，當其被沉默時，導致蠟質中的C26和C30的醇和醛含量降低[13]。 AtKCS2/DAISY和 AtKCS20參與C20到C22超長鏈脂肪酸的延伸[14]，參與植物角質層蠟質和根木栓質的合成[15]。 AtFDH/AtKCS10主要在花和幼嫩葉片中表達，參與表皮細胞中超長鏈脂肪酸的合成[16]。 AtKCS6/AtCer6/AtCUT1主要負責碳鏈長度在C24以上脂肪酸的合成，參與莖及花粉表皮蠟質的合成[17-18]。此外，在番茄中 AtKCS6的同源基因 SlCer6的突變導致表皮蠟質中C28以上的組分含量顯著減少，果實的失水速率增快[19]。在棉花中 AtCer6同源基因的突變引起C26以上的超長鏈脂肪酸含量的減少，致使棉纖維伸長受到抑制[20]。因此，對KCS基因的克隆與功能分析有助于闡明植物超長鏈脂肪酸的生物合成機理。

小麥是主要的糧食作物，其穩產與高產具有重要意義。超長鏈脂肪酸作為生物體內眾多物質的共同合成底物，其合成與降解對生物體正常生長發育至關重要。小麥葉片的表皮蠟質含量與保水性相關，含量越高，葉片保水性越好[21]。在水稻中研究表明，調節脂肪代謝的基因突變會影響花粉的正常生長，造成花粉不育[22]。Schneiter等[23]在酵母中的研究表明，C26的磷脂酰肌醇含量的減少，造成核孔的缺失。小麥KCS基因的功能研究還比較少，通過克隆和功能分析小麥KCS基因，能夠深入了解小麥脂質代謝和蠟質合成中超長鏈脂肪酸的合成。本研究擬通過同源克隆方法從小麥中克隆出KCS基因后，利用生物信息學對其編碼序列進行分析，并將其轉化到酵母中進行表達，以期為小麥超長鏈脂肪酸的生物合成提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材 料

試驗材料為普通六倍體小麥中國春(Chinese Spring)，種植于西北農林科技大學科研溫室。

1.2方 法

1.2.1小麥總RNA的提取

于苗期四葉期取小麥葉片，使用植物RNA小量提取試劑盒(Magen，R4151)提取總RNA。

1.2.2cDNA第一鏈的合成

取1 ng總RNA，按照PrimeScript 反轉錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)說明書進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3小麥KCS基因的克隆

根據擬南芥中的KCS基因序列，分別在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)和Ensembl (http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Tools/Blast)的小麥數據庫中進行BLASTn搜索，尋找相似性較高的片段。利用Primer Premier 5設計引物F1/R1(F1：5′-GAAGGTCACATCATCATCATC-3′；R1：5′-TTCTGTTCCTATAGCCATTTA-3′)， 交由上海生工(Sangon)生物技術公司合成。以1.2.2中得到的cDNA為模板，利用引物F1/R1進行PCR擴增。擴增體系(25 μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 12.5 μL、dNTPs(2 mmol·L-1)5 μL、KOD FX(1.0 U·μL-1)0.3 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.6 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 5 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，31個循環；68 ℃延伸10 min。擴增產物在160 V、200 mA的條件下，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收并純化(TIANGEN，DP214)目的片段，加入rTaq酶和dATP，72 ℃溫浴30 min，完成末端加A。將目的片段連接于pMD18-T載體(TaKaRa)上，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，搖菌后吸取100 μL菌液寄往上海生工生物技術公司測序。

1.2.4序列分析

利用DNAStar軟件包的EditSeq程序和ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找最大的開放閱讀框；在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)對核苷酸序列進行BLASTp分析；運用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對氨基酸序列進行基本理化性質分析；運用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對蛋白的功能結構域進行分析；運用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行跨膜結構域分析；運用DNAMAN 8.0軟件對氨基酸序列進行同源比對；使用MEGA 6.0構建基因進化樹。

1.2.5酵母表達載體的構建與酵母表達

根據釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達載體pYES2和目的基因的DNA序列，設計帶酶切位點的引物F2/R2(F2：5′-CCC AAGCTTAAAAAAATGTCTATGGTCACCGT GCCCGT T-3′，下劃線處為Hind III酶切位點，引入ATG；R2：5′-CCGGAATTCCAGTTAATG CTTGAAAACATCAGT-3′，下劃線處為EcoR I酶切位點)。以pMD18-T- TaKCS6為模板，利用引物F2/R2擴增KCS基因完整的編碼區。將擴增的片段經Hind III和EcoR I雙酶切后，用T4 DNA連接酶連接到經過相同雙酶切的pYES2載體上，轉化大腸桿菌DH5α，經過菌落PCR鑒定和測序鑒定，確定目標基因的序列無突變后，將重組載體pYES2- TaKCS6和空載體pYES2質粒DNA分別轉入釀酒酵母INVSc1菌株中，利用尿嘧啶營養缺陷型培養基(SC-Ura，北京泛基諾)篩選陽性菌株。酵母的轉化和誘導表達參照Denic和Weissman[11]。

1.2.6脂肪酸的抽提及其色譜分析

將經過誘導表達的酵母菌體進行裂解，抽提脂肪酸，經甲醇酯化反應后，進行氣相質譜檢測。甲酯化反應如下：20 mL誘導菌液中加入20 mL 0.9%的NaCl，混勻，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入2 mL 2.5%硫酸-甲醇溶液，80 ℃水浴1.5 h。冷卻后吸取上層抽提液，置于玻璃容器中，過濾后用氮氣吹干，加入正己烷回溶混合物，轉移至色譜分析瓶中。利用GCMS-QP 2010氣相色譜質譜聯用儀對反應后的脂肪酸進行檢測。毛細管色譜柱為RTX-1 (60 m×0.32 mm, 0.25 μm)，進樣口溫度為280 ℃。毛細管柱柱箱從50 ℃開始升溫，保持2 min；然后以8 ℃·min-1的速度升溫至320 ℃，保持10 min。載氣為高純氮氣，試驗使用的分流比是2∶1，檢測器溫度為320 ℃，氫氣流速為40 mL·min-1，空氣流速為400 mL·min-1，進樣量為1 μL。通過目的峰的面積計算超長鏈脂肪酸的相對含量。

2　結果與分析

2.1 TaKCS6基因的克隆及其序列分析

利用特異性引物F1/R1對中國春cDNA進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠檢測后，得到1條大小約1 300 bp的特異性條帶(圖1)。對目的條帶進行切膠回收，將回收到的目的片段連接到pMD18-T載體上，轉入大腸桿菌DH5α中，菌落PCR初步鑒定后，選取3個陽性克隆進行測序。測序結果顯示，3個陽性克隆序列一致，目的片段推測的編碼區全長為1 287 bp，編碼428個氨基酸殘基，將該基因命名為 TaKCS6。

M：DNA Marker DL2000(TaKaRa)；1～3：PCR擴增產物。

M:DNA Marker DL2000(TaKaRa)；1-3:PCR products.

圖1 TaKCS6基因的PCR擴增結果

Fig.1PCR amplification of TaKCS6 gene

2.2TaKCS6蛋白的理化性質分析及結構與功能預測

ProtParam對TaKCS6蛋白基本理化性質分析顯示，該蛋白的相對分子量為47 280.90，理論等電點pI為8.96，半衰期為30 h，在280 nm處消光系數為0.83，不穩定指數為38.50，親脂性為92.59。說明該蛋白為穩定、親脂性蛋白。

結構功能域分析表明，TaKCS6蛋白屬于β-酮脂酰輔酶A合成酶 (KCSs，IPR012392)家族成員，含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶(PF08392, 48～302 aa)和C末端3-酰基ACP合酶III (PF08541, 318～399 aa)結構域(圖2)，該結構域為KCS蛋白功能所必需。跨膜結構分析表明，TaKCS6蛋白具有明顯的跨膜區(圖3)，說明該蛋白可能定位于膜上。

FAE1_CUT1_RppA：III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶；ACP_syn_III_C：3-酰基ACP合酶III；橫線下方數字表示氨基酸位置。

FAE1_CUT1_RppA：FAE1/Type III polyketide synthase-like protein; ACP_syn_III_C:3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)] synthase III, C-terminal; Numbers under the line indicate the position of amino acids.

圖2TaKCS6蛋白的功能域預測

Fig.2Predicted function domains of TaKCS6 protein

圖3　TaKCS6蛋白的跨膜區預測

2.3TaKCS6蛋白的進化分析與序列比對分析

利用克隆到的 TaKCS6基因編碼的氨基酸序列與擬南芥及其他6個近緣物種KCS基因編碼的氨基酸序列構建系統進化樹，結果(圖4)發現，這14條序列主要聚類成兩大類， KCS6同源基因聚為一類，其他的KCS基因聚為一類。在 KCS6同源基因分支中，來源于不同植物的 KCS6基因聚為兩類，一類為雙子葉植物擬南芥 AtKCS6/AtCer6/AtCUT1，另一類為單子葉植物。在單子葉植物分支中，小麥 TaKCS6與烏拉爾圖小麥 TuKCS6和節節麥 AeKCS6聚為一類。

利用DNAMAN 8軟件對來源于不同物種的 KCS6基因編碼的氨基酸序列進行多重序列比對分析，結果(圖5)表明， TaKCS6基因編碼的氨基酸序列與其他物種的 KCS6基因編碼的氨基酸序列在III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶(PF08392，圖5 I)和C末端3-酰基ACP合酶III (PF08541，圖5II)功能結構域上具有一定的相似性。TaKCS6氨基酸序列與擬南芥AtKCS6氨基酸序列一致性為50.00%，與烏拉爾圖小麥、節節麥、高粱和水稻相似性分別為71.54%、72.73%、52.77%和52.96%。TaKCS6氨基酸序列與擬南芥AtKCS6氨基酸序列的第225位半胱氨酸殘基、第388位、第392位與第421位的組氨酸殘基和第425位的天冬酰胺殘基具有一致性，而這五個殘基與第304位的組氨酸殘基是擬南芥AtKCS6蛋白正常催化所必需的活性位點。

At:擬南芥；Ae:節節麥；Bn:甘藍型油菜；Hv:高粱；Os:水稻；Tu:烏拉爾圖小麥；Ta:普通小麥；Zm:玉米。下同。

At:Arabidopsisthaliana；Ae:AegilopstauschiiCoss.；Bn:BrassicanapusL.；Hv:HordeumvulgareL.；Os:Oryzasativa；Tu:Triticumurartu；Ta:TriticumaestivumL.；Zm:ZeamaysL..The same as below.

圖4不同植物中KCS基因編碼氨基酸序列的系統進化樹分析

Fig.4Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences ofKCSgenes in different plants

I和II分別為AtKCS6蛋白的FAE1_CUT1_RppA(PF08392)與ACP_syn_III_C (PF08541)功能結構域；1～6分別表示 AtKCS6蛋白的C225、H304、H388、H392、H421和N425活性位點。

I and II:Function domains FAE1_CUT1_RppA(PF08392) and ACP_syn_III_C (PF08541) of AtKCS6 protein;1-6:Activity sites C225, H304, H388, H392, H421 and N425 of AtKCS6 protein.

圖5TaKCS6氨基酸序列與其他植物的KCS6氨基酸序列的比對

Fig.5Multiple alignment of KCS6 amino-acid sequences inTriticumaestivumL. and other plants

2.4酵母表達載體pYES2- TaKCS6的構建及其轉化誘導

將帶酶切位點的 TaKCS6基因片段與環狀的pYES2載體分別進行雙酶切后，利用T4連接酶連接，即目的片段插入到半乳糖誘導的啟動子pGAL1與終止子CYC1 TT間(圖6)。將構建好的pYES2- TaKCS6載體轉入大腸桿菌DH5α中，經雙酶切(圖7)與測序確保閱讀框的正確性后，轉化到釀酒酵母INVSc1菌株中，篩選得到單克隆陽性菌株。利用尿嘧啶缺陷型培養基(SC-Ura)與半乳糖培養酵母并誘導 TaKCS6基因的表達。

2.5氣相質譜聯用儀(GC-MS)分析酵母超長鏈脂肪酸的組成

提取經誘導的酵母中的脂肪酸后，使用GC-MS聯用儀對甲酯化的脂肪酸進行檢測，結果(圖8、圖9)表明，與空載體相比， TaKCS6基因表達產物中，棕櫚酸(16∶0)相對含量由70.60%減少到了58.70%， 二十六酸(26∶0)相對含量由3.06%增加到了12.42%，并且檢測到了二十八酸(28∶0)的積累，相對含量為2.32%。證明該基因的編碼產物參與了超長鏈脂肪酸的延伸，使得C26以下的超長鏈脂肪酸向C26及以上的超長鏈脂肪酸延伸。鑒于二十六酸的相對含量顯著增加，推測TaKCS6蛋白的特異性反應底物為C24的超長鏈脂肪酸。

圖6　 酵母表達載體pYES2- TaKCS6的構建

M：DNA Marker DL5000(TaKaRa)；1～4：雙酶切產物。

M：DNA Marker DL5000(TaKaRa)；1-4：Products of double enzyme digestion.

圖7pYES2- TaKCS6的雙酶切鑒定

Fig.7Double enzyme digestion of pYES2- TaKCS6

16∶0：棕櫚酸；18∶0：硬脂酸；20∶0：花生酸；22∶0：山萮酸；24∶0：木蠟酸；26∶0：二十六酸；28∶0：二十八酸。下同。

16∶0：Palmitic acid； 18∶0:Stearic acid； 20∶0:Arachic acid； 22∶0：Behenic acid；24∶0：Lignoceric acid；26∶0：Hexacosanic acid；28∶0：Octacosanoic acid. The same as below.

圖8酵母超長鏈脂肪酸的相對含量

Fig.8Relative content of very-long-chain

fatty acids in yeast

圖9　GC-MS分析酵母超長鏈脂肪酸成分

3　討 論

KCS基因作為VLCFAs合成過程中的關鍵基因，對VLCFAs的碳鏈長度有著決定性的作用[10-11]，并參與植物體內眾多重要物質的合成[4]。目前，在擬南芥、棉花、番茄、水稻等植物中克隆得到了部分KCS基因[10, 14, 16-17, 19, 24-25]，并對其功能進行了分析。本研究通過同源克隆方法，克隆得到了含有完整編碼序列的小麥 TaKCS6基因，序列分析表明，開放閱讀框全長為1 287 bp，可編碼428個氨基酸殘基，具有親脂性。結構域分析表明，TaKCS6蛋白屬于β-酮脂酰輔酶A合成酶 (KCSs，IPR012392)家族，分別在N端和C端含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和3-酰基ACP合酶III結構域，并且在N段存在兩個跨膜結構，這都與Hooker等[17]和Millar等[18]所克隆得到的 AtKCS6基因所編碼的蛋白序列相吻合，推測TaKCS6蛋白定位于內質網，這有待進一步的研究。系統進化樹分析結果表明，不同物種中的 KCS6基因聚為一類，其中小麥的 KCS6基因與烏拉爾圖小麥、節節麥、水稻和高粱的 KCS6基因聚為了一類，證明這些物種之間該基因在進化上保持一致。

蛋白序列的多重比對表明，KCS6在關鍵的功能結構域處，序列較為保守，都存在KCS蛋白所必需的III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和3-酰基ACP合酶III結構域，TaKCS6蛋白序列和其他物種的KCS6蛋白與AtKCS6蛋白的5個及以上活性位點的氨基酸殘基相同，表明這些蛋白的功能存在一致性，證明這些蛋白序列都具有催化合成超長鏈脂肪酸的功能。這與Yu等[24]的研究結果相符，表明不同植物的KCS基因都存在著極端保守的序列，這是KCS基因發揮功能所必須的。 TaKCS6基因在酵母中的表達結果表明，TaKCS6蛋白能夠催化合成C24以上的超長鏈脂肪酸，這與Tresch等[26]在酵母中對AtKCS6表達產物的研究結果一致。

Xiao等[27]研究表明，赤霉素能夠使得部分棉花的KCS基因上調表達，進而產生更多的超長鏈脂肪酸，影響乙烯的合成最終影響纖維的生長。Qin等[20]研究表明，超長鏈脂肪酸能激活乙烯的合成途徑，影響棉花纖維和擬南芥莖稈的伸長。而在小麥中，Hu等[28]發現ABA與PEG誘導KCS基因的表達，表明小麥KCS基因的表達受到激素的誘導，參與植物的逆境響應。在擬南芥21個KCS基因中，有6個KCS基因[10,13-18]參與蠟質的合成，蠟質對植物的保水抗旱性有著重要的影響[8]。小麥中葉片表皮蠟質的主要成分為C28脂肪醇[29]，推測TaKCS6可能參與小麥表皮蠟質的合成。

以上研究結果表明，雖然小麥 TaKCS6基因與擬南芥 AtKCS6基因的編碼蛋白序列一致性不是很高，但是，在兩個重要的功能結構區和活性位點相對應的氨基酸殘基一致性較好，表明TaKCS6蛋白能夠正常的發揮催化作用。在酵母表達中，也證明了該蛋白具有催化合成C24以上鏈長的超長鏈脂肪酸的功能。因此，TaKCS6的克隆與酵母表達對揭示小麥KCS基因的功能具有重要意義。本研究為進一步研究小麥KCS的功能及其表達模式奠定了基礎。

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Cloning and Yeast Expression of 3-ketoacyl-coenzyme Synthase (KCS) Gene in Wheat(TriticumaestivumL.)

XIA Lingfeng, SHI Xue, YANG Haohong, LI Chunlian, WANG Zhonghua, QUAN Li

(College of Agronomy, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling, Shaanxi 712100, China)

Very-long-chain fatty acids (VLCFAs) are the synthetic substrates for many important substances in the living body. TheKCSgene encodes β-ketoacyl CoA synthase, a rate-limiting enzyme in the synthesis of VLCFAs, catalyzing the condensation reaction of VLCFAs elongation process. In order to identify the function ofKCSgene in biosynthesis of VLCFAs, the homologous cloning strategy was used to cloneKCSgene from wheat(TriticumaestivumL.), the coding sequence was analysed by a series of bioinformatics software and expressed in yeast(Saccharomycescerevisiae).The result showed that the open reading frame of TaKCS6 gene is 1 287 bp, which encodes 428 amino acid residues. Functional domain analysis predicted that TaKCS6 protein belonging to KCSs protein family, contains FAE1_CUT1_RppA and ACP_syn_III_C domains. The amino acid sequences of TaKCS6, AtKCS6 and KCS6 from other plants are conservative in two functional domains and activity sites. Yeast expression of TaKCS6 showed that encoded protein is involved in the elongation of VLCFAs more than 24 carbons.

TriticumaestivumL.; Very-long-chain fatty acids;KCSgene;Yeast expression

2016-05-12

2016-08-15

國家自然科學基金項目(31471568)；陜西省重點科技創新團隊項目(2014KCT-25)；西北農林科技大學唐仲英育種項目；西北農林科技大學基本科研業務費一般項目(QN2013006)

E-mail：laughingxia@126.com

王中華(E-mail:zhonghuawang@nwsuaf.edu.cn)；權 力(E-mail:lquan@nwafu.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)09-1121-09

網絡出版時間：2016-08-31

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160831.1648.002.html