逆境脅迫下小麥脂肪氧化酶基因表達(dá)的qRT-PCR分析

張福彥，陳 鋒，張建偉，楊保安，范家霖，陳曉杰，陳云堂，崔 龍

(1.河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司/河南省核農(nóng)學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450015；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

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逆境脅迫下小麥脂肪氧化酶基因表達(dá)的qRT-PCR分析

張福彥1,2，陳 鋒2，張建偉1，楊保安1，范家霖1，陳曉杰1，陳云堂1，崔 龍1

(1.河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司/河南省核農(nóng)學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450015；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

為探討小麥脂肪氧化酶基因在非生物脅迫過程中的生物學(xué)功能，采用qRT-PCR技術(shù)，首先分析了 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在小麥幼葉、莖、根以及成熟籽粒中的表達(dá)情況，其次分析了這2個基因在高鹽、低溫、高溫和干旱脅迫下葉片中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，這2個基因在小麥根、莖、葉以及成熟籽粒中均有表達(dá)，但 TaLox-B2基因主要在葉和成熟籽粒中表達(dá)，而 TaLox-B3基因主要在根和葉中表達(dá)。在高鹽脅迫下，這2個基因的表達(dá)趨勢大體一致，類似于正態(tài)分布，在3 h時達(dá)到峰值。在低溫逆境下， TaLox-B2基因的表達(dá)模式無明顯規(guī)律，而 TaLox-B3基因在0～6 h范圍內(nèi)呈上調(diào)表達(dá)，之后開始逐漸下降。在高溫逆境下，這2個基因在0～12 h范圍內(nèi)均呈下調(diào)表達(dá)，但二者下調(diào)的趨勢明顯不同。在模擬干旱脅迫下，這2個基因相對表達(dá)量均較低，表達(dá)趨勢存在明顯差別，但二者的表達(dá)模式則無明顯規(guī)律。推測認(rèn)為， TaLox-B2和 TaLox-B3基因主要受鹽脅迫誘導(dǎo)，且與PEG干旱脅迫之間沒有特定的關(guān)系，此外，溫度變化對 TaLox-B2和 TaLox-B3基因表達(dá)量的影響較為明顯，但低溫和高溫的作用機(jī)制不同。

普通小麥；逆境脅迫；脂肪氧化酶基因；表達(dá)分析

面粉色澤是評價小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，對面粉或面制品的商品性具有重要影響[1]。面粉中八氫番茄紅素合成酶、多酚氧化酶、脂肪氧化酶等其他過氧化物酶通過對黃色素和類胡蘿卜素等色素類物質(zhì)的氧化降解，進(jìn)而對面粉或面制品色澤產(chǎn)生影響[2-4]。在小麥中，脂肪氧化酶(Lipoxygenase，Lox)含量雖然較低，但對面粉或面制品色澤等具有重要影響，現(xiàn)已成為小麥品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。

小麥籽粒Lox活性可遺傳率較高，基因型是決定小麥Lox活性的最主要因素[5-6]。Hart和Langston[7]利用中國春缺體-四體代換系對硬粒小麥Lpx同工酶進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Lpx-A1、Lpx-B1和 Lpx-D1分別位于4AL、4BL和4DS染色體上，而 Lpx-A2、 Lpx-B2和 Lpx-D2分別位于5AL、5BL和5DL上，因而推測小麥Lox基因主要位于第4和第5同源群上。隨著大麥和硬粒小麥中Lox基因被克隆和定位[8-10]，普通小麥中Lox基因的克隆、定位及與之緊密連鎖的分子標(biāo)記的開發(fā)等也取得了一定的進(jìn)展。Feng等[11]采用同源克隆的方法從普通小麥品種小偃54中克隆了位于4DS染色體上的 TaLox1基因和位于5DL染色體上的 TaLox2n基因，并對二者在成熟籽粒中的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) TaLox1比 TaLox2n基因表達(dá)量更高，說明 TaLox1基因?qū)π←溩蚜ox活性作用更為明顯[11]。之后，又利用同樣的方法從普通小麥中克隆出一個新Lox基因，命名為 TaLox3，將其定位在4A染色體上[12]。Geng等[13]利用電子克隆方法克隆得到普通小麥4B染色體上的 TaLox-B1基因，且發(fā)現(xiàn)了其至少含有2種等位變異類型，分別命名為 TaLox-B1a和 TaLox-B1b，二者gDNA序列間存在單核苷酸多態(tài)性，根據(jù)該多態(tài)性開發(fā)1對共顯性互補(bǔ)功能性分子標(biāo)記Lox16和Lox18。Garbus等[14]先后在普通小麥中克隆發(fā)現(xiàn)了與硬粒小麥中類似的 Lpx-A1-like、 Lpx-B1.2和 Lpx-D1基因，并將其分別定位在4A、4B和4D染色體上。之后，Zhang等[15]采用電子克隆技術(shù)從普通小麥4BS染色體上克隆得到2個與Lox活性關(guān)系密切的新基因，命名為 TaLox-B2和 TaLox-B3，且發(fā)現(xiàn) TaLox-B2基因存在2種等位變異類型，將其命名為 TaLox-B2a和 TaLox-B2b，同時，根據(jù)三者基因的gDNA序列差異開發(fā)了功能性分子標(biāo)記Lox-B23。盡管已有關(guān)于普通小麥籽粒Lox基因克隆、功能標(biāo)記開發(fā)和檢測以及Lox活性分析等的相關(guān)報道，但有關(guān)小麥Lox基因在非生物脅迫過程中的生物學(xué)功能的報道很少。

本研究以小麥 β-actin基因為對照，利用qRT-PCR技術(shù)，先分析 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在小麥幼葉、莖、根以及成熟籽粒中的表達(dá)情況，其次分析以上2個因基在高鹽、低溫、高溫和干旱脅迫下葉片中的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步了解小麥籽粒脂肪氧化酶基因的生物學(xué)功能和分子遺傳基礎(chǔ)提供一定的幫助。

1　材料與方法

1.1試驗材料及其處理

供試材料包括2014年河南省最新審定的小麥品種豫農(nóng)211、1997年河北省審定的小麥品種石4185及目前全國推廣面積最大的小麥品種矮抗58，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種研究室提供。挑選籽粒飽滿的小麥種子，經(jīng)雙氧水消毒后播種于培養(yǎng)皿中，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，于光/暗周期為12 h/12 h、溫度為22～25 ℃的條件下培養(yǎng)。待幼苗長至三葉一心期時，分別取各小麥品種的幼葉、莖和根，同時將矮抗58幼苗分別在4 ℃低溫、42 ℃高溫、100 mmol·L-1NaCl以及20% PEG6000共4種逆境脅迫環(huán)境下分別處理0、1、3、6、12和24 h后取其葉片，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取

分別取適量1.1中保存于-80 ℃超低溫冰箱中的小麥幼葉、莖和根，加入液氮后迅速研磨至粉末狀，采用Trizol法提取總RNA，具體操作步驟參照南海波[16]的方法進(jìn)行。同時，參照胡群文等[17]提取小麥種子RNA的方法提取供試各小麥品種成熟種子RNA。

1.2.2cDNA第一鏈的合成

以提取的總RNA為模板，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Prime Script○RRT reagent Kit With gDNA Eraser， 寶生物工程(大連)有限公司]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。

1.2.3特異性引物的設(shè)計

利用DNAMAN Version 6.0進(jìn)行序列分析，采用Primier Primer 5.0設(shè)計特異性引物。根據(jù)Zhang等[15]新克隆的小麥籽粒 TaLox-B2和 TaLox-B3基因的gDNA序列設(shè)計2對特異性引物L(fēng)ox-P2和Lox-P3；以小麥中穩(wěn)定表達(dá)的肌動蛋白基因 β-actin(GI：48927671)序列設(shè)計1對特異性引物WAC，作為內(nèi)參。引物合成均在生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行，具體引物序列信息見表1。

1.2.4表達(dá)分析

RT-PCR反應(yīng)在美國伯樂iQ5實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行。3次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，10 pmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix ExTaqII(2×)[寶生物工程(大連)有限公司]10 μL，ddH2O 7 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，UV掃描成像后確認(rèn)是否與擴(kuò)增曲線結(jié)果吻合。最后，采用2-△△Ct法[18]計算基因的相對表達(dá)量。

表1　RT-PCR特異性引物序列信息Table 1　Specific primer sequence for RT-PCR

2　結(jié)果與分析

2.1 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在小麥不同器官中的表達(dá)

利用RT-PCR分析 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在矮抗58、石4185和豫農(nóng)211小麥品種的不同器官中的表達(dá)，結(jié)果(圖1)表明， TaLox-B2基因在石4185、矮抗58以及豫農(nóng)211的不同器官中均表達(dá)，且在葉中表達(dá)水平明顯高于根、莖和成熟籽粒，成熟籽粒中的表達(dá)水平略高于根、莖，而根中表達(dá)水平最低(圖1A)。 TaLox-B3基因在石4185和豫農(nóng)211的不同器官中均不表達(dá)，而在矮抗58的不同器官中均表達(dá)，且在根中表達(dá)水平明顯高于葉、莖和成熟籽粒，在葉中的表達(dá)水平略高于成熟籽粒和莖，而在莖中表達(dá)水平最低(圖1B)。由此可見，小麥 TaLox-B2基因的表達(dá)強(qiáng)度依次為葉>成熟籽粒>莖>根，而 TaLox-B3基因的表達(dá)強(qiáng)度依次為根>葉>成熟籽粒>莖。

2.2 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在脅迫處理下的特異性表達(dá)

利用RT-PCR分析經(jīng)高鹽、低溫、高溫和干旱脅迫處理后的矮抗58葉片中 TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2～5所示。

在4 ℃低溫條件下， TaLox-B2基因在0～1 h

圖1　 TaLox-B2和 TaLox-B3基因在普通小麥品種不同器官中的相對表達(dá)水平

迅速上調(diào)表達(dá)，在1 h時達(dá)到最大，約為起始表達(dá)量的1.5倍，此后表達(dá)量下降，在3 h時表達(dá)量接近起始水平，之后又開始上升，在6 h時達(dá)到峰值，此時約為起始表達(dá)量的1.1倍，之后又開始平緩下降，24 h時 TaLox-B2的相對表達(dá)量較弱； TaLox-B3基因在0～6 h迅速上調(diào)表達(dá)，在6 h時達(dá)到最大，此時約為起始表達(dá)量的2.6倍，之后表達(dá)量逐漸下降，24 h時其表達(dá)量達(dá)到最低，此時與 TaLox-B2的相對表達(dá)水平非常接近(圖2)。

圖2　4 ℃低溫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

42 ℃高溫條件下， TaLox-B2基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢，在0～1 h平緩下降，之后開始急劇下降，在12 h時達(dá)到最低，此時約為起始表達(dá)量的1/20，之后又開始緩慢上升，24 h時約達(dá)到最低表達(dá)量時的4倍； TaLox-B3基因也呈下調(diào)表達(dá)趨勢，在0～12 h平緩下降，在12 h時達(dá)到最低，此時約為起始表達(dá)量的1/10，之后又開始緩慢上升，24 h時達(dá)到最低表達(dá)量時的2.2倍(圖3)。

圖3　42 ℃高溫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

在100 mmol·L-1NaCl處理條件下， TaLox-B2基因在0～3 h平緩上升，在3 h時達(dá)到最高，此時約為起始表達(dá)量的2.4倍，之后開始緩慢下降，但到12 h以后下降速度減慢，基本處于一個穩(wěn)定的狀態(tài)； TaLox-B3基因在0～3 h急劇上升，在3 h時達(dá)到最高，此時約為起始表達(dá)量的5倍，之后開始下降，在12 h時達(dá)到最低，此時相對表達(dá)量與起始表達(dá)量相當(dāng)，但略低于起始表達(dá)量，此后又開始緩慢上升，在24 h時的相對表達(dá)量約為起始表達(dá)量的1.4倍(圖4)。

在20% PEG6000脅迫條件下， TaLox-B2基因在0～3 h平緩上升，在3 h時達(dá)到一個峰值，之后開始下降，在12 h時達(dá)到另外一個峰值，之后開始急劇下降，在24 h時的相對表達(dá)量約為起始表達(dá)量的1/3倍； TaLox-B3基因在0～1 h呈下調(diào)表達(dá)，之后開始上升，且在3 h和12 h分別有一個峰值，在24 h時的相對表達(dá)量約為起始表達(dá)量的1/4倍(圖5)。

圖4　100 mmol·L-1 NaCl脅迫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

圖5　 干旱脅迫條件下矮抗58葉片中 TaLox-B2和TaLox-B3基因的表達(dá)

3　討 論

脂肪氧化酶廣泛存在于各種植物中，植物在受到外源傷害或病原菌侵染時Lox表達(dá)增強(qiáng)，而Lox的催化產(chǎn)物脂氫過氧化物及其次生產(chǎn)物可以降解為傳遞生物脅迫和非生物脅迫信息的信號因子，以增強(qiáng)對昆蟲和真菌病害的敏感性，進(jìn)而對植物起到一定的保護(hù)作用[19]。目前，脂肪氧化酶在擬南芥、馬鈴薯、大麥、水稻以及大豆等植物中關(guān)于生理基礎(chǔ)和分子生物學(xué)方面的研究較為深入。Hildebrand等[20]研究認(rèn)為，大豆葉片中的Lox與反應(yīng)底物是分開的，但在其受到逆境脅迫，并產(chǎn)生組織損傷后，Lox能與底物進(jìn)行結(jié)合，脂肪氧化酶蛋白及其活性會急劇增加，并形成新的脂肪氧化酶同工酶。而Shukle等[21]發(fā)現(xiàn)從大豆中提取的脂肪氧化酶可以有效的阻止煙草天蛾幼蟲的生長發(fā)育，因此他們認(rèn)為脂肪氧化酶在大豆植物體內(nèi)能直接起到抵御有害生物危害的功能。Royo等[22]從馬鈴薯中克隆出與逆境脅迫相關(guān)的 Lox1、 Lox2和 Lox3基因，研究發(fā)現(xiàn) Lox1在塊莖和根中特異性表達(dá)， Lox3基因則在葉片和根中表達(dá)，而 Lox2只在葉片中表達(dá)，說明Lox基因具有特定的組織表達(dá)特異性；對馬鈴薯葉片進(jìn)行傷害處理后，研究發(fā)現(xiàn) Lox3基因的表達(dá)量在0.5 h后迅速增強(qiáng)，而 Lox2基因的表達(dá)量在24 h內(nèi)呈遞增趨勢，從而說明了植物體內(nèi)不同的Lox基因在應(yīng)對逆境生物脅迫時扮演著不同的角色。脂肪氧化酶在普通小麥抗逆境方面的研究也取得一定的研究進(jìn)展。Ocampo等[23]通過研究小麥Lox活性與小麥植株抗病性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)小麥植株受到病原體侵染時，植物組織中Lox活性迅速提高，并刺激產(chǎn)生相應(yīng)的創(chuàng)傷素、植物二烯酸以及脫落酸等來阻止病原體進(jìn)一步入侵。張榮平等[24]在模擬干旱和高溫條件下研究冬小麥不同品種胚根脂氧合酶(Lox)活性變化，發(fā)現(xiàn)抗旱-抗熱性強(qiáng)的小麥品種胚根中Lox活性只有較小幅度的上升，而抗旱-抗熱性弱的品種Lox活性則有較大幅度的上升。說明植物體內(nèi)Lox活性含量的變化情況與植物所在外界環(huán)境密切相關(guān)。本研究對控制小麥籽粒Lox活性主效基因 TaLox-B2和 TaLox-B3的表達(dá)模式以及對各種脅迫的響應(yīng)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫和NaCl脅迫時 TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)量在短時間內(nèi)迅速上升，以增強(qiáng)植物對外界環(huán)境的敏感性，進(jìn)而對小麥植株起到保護(hù)作用，這與Ocampo等[23]和張榮平等[24]的研究結(jié)果基本一致；而在高溫脅迫時， TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)量呈下降趨勢，這與低溫和NaCl脅迫時的Lox基因的作用機(jī)制明顯不同，需進(jìn)一步深入研究；干旱脅迫時， TaLox-B2和 TaLox-B3基因的表達(dá)量均較低，且沒有明顯規(guī)律，表明二者的表達(dá)可以與滲透脅迫無關(guān)，主要是離子脅迫誘導(dǎo)其表達(dá)。

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Expression Analysis of Wheat Lipoxygenase Genes at Different Stress Conditions by Quantitative Real-Time PCR

ZHANG Fuyan1,2,CHEN Feng2,ZHANG Jianwei1,YANG Baoan1,FAN Jialin1,CHEN Xiaojie1,CHEN Yuntang1,CUI Long1

(1.Isotope Institute Co.,Ltd,Henan Academy of Sciences/Henan Key Laboratory of Nuclear Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan 450015,China; 2.Agronomy College,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Food Crops in Henan Province,Zhengzhou,Henan 450002,China)

To explore the biology function of wheat lipoxygenase genes under abiotic stress,we used the quantitative real-time PCR to deduce the expression profiling of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes in roots,stems,leaves and mature seeds of wheat and the expression analysis of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes in leaves under salt-stress treatment (100 mmol·L-1NaCl),low temperature-stress treatment (4 ℃),high temperature-stress treatment(42 ℃) and drought-stress treatment(20% PEG6000). The results showed that TaLox-B2 and TaLox-B3 genes could express in various tissues of wheat,including roots,stems,leaves and mature seeds. The expression of TaLox-B2 was mainly in the leaves and mature seeds,while TaLox-B3 was expressed primarily in the roots and leaves. The expression trends of TaLox-B2 and TaLox-B3 were similar to normal distribution and reached a peak at 3 h under high salinity. TaLox-B2 gene did not show a significant trendline under low temperature-stress treatment. The expression of TaLox-B3 gene was up-regulated at low temperature from 0 h to 6 h,and began to gradually decline afterwards. The expression of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes were down-regulated at high temperature-stress treatment from 0 h to 12 h.However,the TaLox-B2 and TaLox-B3 genes showed obviously different trendlines. TaLox-B2 and TaLox-B3 genes showed obviously different expression profiles,respectively,and their expression levels were very low,while there were no clear expression tendency were observed under the treatment of PEG6000. To summarize, TaLox-B2 and TaLox-B3 were mainly induced by salt-stress,but no specific relationship with PEG drought stress was found. In addition,the expression of TaLox-B2 and TaLox-B3 genes have more obvious influence on the temperature changes,but the mechanism of the effect of the low temperature and high temperature are different.

TriticumaestivumL.; Stress; Lipoxygenase genes; Expression analysis

2016-03-09

2016-05-06

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃資助項目(162300410169；152300410141)；河南省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目(Z2010-01-04)；鄭州市重大科技攻關(guān)項目(121PZDGG071)

E-mail:zhangfuyan704@163.com

張建偉(E-mail:zjw10308@163.com)；楊保安(E-mail:yangcorn@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)09-1153-06

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-08-31

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160831.1649.010.html